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Elektrophorese veraltet Kataphorese bezeichnet die Wanderung geladener kolloidaler Teilchen oder gelöster geladener Mole

Elektrophorese

Elektrophorese (veraltet Kataphorese) bezeichnet die Wanderung geladener kolloidaler Teilchen oder gelöster geladener Moleküle durch ein elektrisches Feld.

Elektrophorese mit DNA-Fragmenten, die über PCR gewonnen wurden;
(1) ist der Vater,
(2) das Kind,
(3) die Mutter.

Der Pionier der Elektrophorese war Arne Tiselius (1937). Zum Durchbruch kam die Technik, nachdem Oliver Smithies 1955 herausgefunden hatte, dass sich Stärkegele sehr gut für die Elektrophorese eigneten (später weitgehend zum Beispiel durch Acrylamid verdrängt).

Beschreibung Bearbeiten

Die Driftgeschwindigkeit (auch „Wanderungsgeschwindigkeit“) der kolloidalen Teilchen, typischerweise Proteine oder Nukleinsäuren, ist bei der Elektrophorese proportional zur Feldstärke und zur Ionenladung , umgekehrt proportional zum Teilchenradius und zur Viskosität des Stoffes. Außerdem spielt das Ionenmilieu der Lösung, in dem elektrischer Strom fließt, eine wesentliche Rolle. Physikalische Ursache der Bewegung ist die Scherkraft in der elektrischen Doppelschicht, die das Kolloid umgibt (Stern-Doppelschicht) und die geladene Flüssigkeit in relative Bewegung zum Makromolekül setzt. Bei der Gelelektrophorese spielt auch das Verhältnis zwischen dem Teilchenradius und der Porenweite des als Trägermedium dienenden Gels eine Rolle, weil das Gel als Molekularsieb wirkt, so dass sich ein größerer Teilchenradius stärker hemmend auf die Wanderungsgeschwindigkeit auswirkt, als nur durch die Viskosität allein zu erwarten wäre. Durch die unterschiedliche Ionenladung und den Teilchenradius bewegen sich die einzelnen Stoffe (Moleküle) unterschiedlich schnell durch das Trägermaterial und erreichen eine Auftrennung entsprechend ihrer elektrophoretischen Mobilität. Damit eignet sich die Elektrophorese sehr gut zur Trennung von Stoffgemischen (insbesondere Molekülgemischen). Als Trägermaterial können Flüssigkeiten, Gele (siehe Gelelektrophorese, meistens mit Polyacrylamid oder Agarose) oder Feststoffe zum Einsatz kommen.

Agarose-Gele kommen vor allem bei der Auftrennung von DNA-Fragmenten zum Einsatz, während Proteine meist in Polyacrylamid-Gelen aufgetrennt werden. Als Verfahren kommen bei Proteinen SDS-PAGE und Western Blot zum Einsatz. Proteine müssen als Zwitterionen mit zusätzlichen Ladungen durch ein Detergens wie Natriumdodecylsulfat (englisch sodium dodecyl sulfate, SDS) beladen werden, um von einer Auftrennung nach den heterogenen Ladungsdichten zu einer Auftrennung nach der Molekülmasse zu kommen. Durch Zugabe von SDS und Aufkochen (Denaturieren) adsorbieren die Proteine proportional zu ihrer aufgefalteten Länge (und auch proportional zur Molekülmasse) das aliphatische Ende des negativ-geladenen Natriumlaurylsulfats. Dabei binden circa 1,4 Gramm SDS pro Gramm Protein in einprozentigen SDS-Lösungen. Die negativ geladenen Sulfatgruppen der SDS-Moleküle stoßen sich gegenseitig ab, was die Auffaltung (Linearisierung) der Proteine fördert, sofern das Protein keine Disulfidbrücken aufweist. Daher werden bei der Molmassenbestimmung zusätzlich Reduktionsmittel zur Überführung der Disulfide in Thiole hinzugegeben. Da mehrere hundert negativ geladene SDS-Moleküle an die Proteinmoleküle binden, kann die Eigenladung der Proteine im basischen pH des Gels vernachlässigt werden.

Elektrophoretische Mobilität Bearbeiten

Zwei SDS-Gele nach dem Ende des Probenlaufs und Färbung der Proteinbanden mit Coomassie

Die elektrophoretische Mobilität von zwei zu trennenden Teilchen muss unterschiedlich sein, um eine Trennung mittels Elektrophorese zu erreichen. Die elektrophoretische Mobilität ist die Summe vieler physikalischer Faktoren, die letztendlich die Wanderungsgeschwindigkeit eines Teilchens während der Elektrophorese beeinflussen. Die generell treibende Kraft, die die Bewegung der Teilchen hervorruft, ist die Kraft , die auf ein Teilchen mit bestimmter Ladung innerhalb eines elektrischen Feldes mit gegebener Feldstärke wirkt.

Dem entgegen wirkt zunächst eine Kraft, die sich durch die Viskosität und die Größe des Teilchens (idealisiert für sphärische Teilchen: ) ergibt, und nach dem Gesetz von Stokes berechnet werden kann.

Aus diesen beiden Gleichungen ergibt sich die theoretische elektrophoretische Mobilität . Theoretisch aus dem Grund, da diese beiden Gleichungen nur für einen idealisierten, trägerfreien Zustand mit unendlich verdünntem (praktisch salzfreien, was jedoch dem Prinzip der Elektrophorese widerspricht, da Salzionen als bewegliche Ladungsträger benötigt werden) Elektrolyten gelten. Weiterhin wird dabei angenommen, dass die beschleunigende Kraft der Reibungskraft entspricht und daher eine konstante Wanderungsgeschwindigkeit vorherrscht. Daher ergibt sich in diesem Modell die Ionenbeweglichkeit wie folgt:

In realen Systemen kommen weitere Faktoren wie die Reibung zwischen den Hydrathüllen (elektrophoretischer Effekt), die Deformation der Ladungsverteilung als Relaxation im elektrischen Feld (dissipativer Effekt, siehe Ionenatmosphäre), der Dissoziationsgrad des Elektrolyten und Effekte durch das Trägermaterial (Molekularsieb-, Elektroosmose- und Adsorptionseffekte) zum Tragen.

Während traditionelle Theorien davon ausgehen, dass elektrophoretische Aktivität eines Teilchens eine Nettoladung des Teilchens voraussetzt, legen neue Ergebnisse aus Molekulardynamiksimulationen nahe, dass aufgrund der molekularen Struktur des Wassers an der Oberfläche auch ungeladene Teilchen elektrophoretische Aktivität zeigen können.

Offord fand empirisch folgende Beziehung zwischen der Mobilität und der Nettoladung und Molmasse:

Wärme Bearbeiten

Die maximale anlegbare Spannung wird durch die Erwärmung des Gels begrenzt, die durch Reibungseffekte der wandernden Moleküle entsteht. Die Wärme kann zu ungleichmäßiger Wanderung der Moleküle führen, vermehrt die Diffusion (resultierend in unschärferen Banden) und kann die Moleküle denaturieren. Die Wärmeentwicklung wird von der angelegten Spannung und der elektrischen Leitfähigkeit des verwendeten Systems bestimmt, insbesondere von der Leitfähigkeit des Elektrophoresepuffers.

Arten Bearbeiten

Anwendung Bearbeiten

Angewandt wird die Elektrophorese vor allem als Analyseverfahren in der Biologie und Medizin. Zu den wichtigsten Anwendungen gehören die Serumelektrophorese sowie die DNA-Analyse in Form von Fragmenten und DNA-Sequenzierung. Hierbei wird die Möglichkeit genutzt, Moleküle unterschiedlicher Länge voneinander zu trennen. Zur Bestimmung der Messwerte eines Geles wie z. B. Laufweiten, Molmassen, Quantifizierungen oder Normalisierung wird eine spezialisierte Auswertesoftware genutzt. Auch zur Trennung von Proteinen und für die hochtechnologischen Verfahren der Proteomforschung bildet die Elektrophorese die Grundlage. Die graphische Darstellung der Ergebnisse ist ein Elektropherogramm. Neben den analytischen Verfahren werden zur Gewinnung von Milligramm-Mengen gereinigter Proteine auch präparative Elektrophoreseverfahren eingesetzt (u. a. Free-Flow-Elektrophorese).

Weitere, technische Anwendungen:

Geschichte Bearbeiten

Elektrophoretische Effekte wurden erstmals 1807 von Pjotr Iwanowitsch Strachow und Ferdinand Friedrich von Reuß untersucht. Die Elektrophorese wurde 1937 von Arne Tiselius entwickelt, als Methode mit der Kolloide in einer Trägerflüssigkeit in einem elektrischen Feld getrennt werden konnten (englisch moving boundary electrophoresis ‚Elektrophorese mit beweglicher Grenzschicht‘). Tiselius erhielt dafür 1948 den Nobelpreis für Chemie. In den 1940er-Jahren wurden zunehmend feste Phasen zur besseren Trennung verwendet (englisch zone electrophoresis ‚Zonenelektrophorese‘), wie das Stärkegel von Oliver Smithies oder auch Filterpapier. Da diese zur mikrobiellen Zersetzung neigen, wurden in Folge auch andere Hydrogele verwendet, z. B. Agarose oder Polyacrylamid. Während in den 1950er-Jahren oftmals noch eine radiale Elektrophorese auf runden Scheiben durchgeführt wurde (englisch radial electrophoresis ‚Scheiben-Elektrophorese‘), werden heute fast ausschließlich rechteckige Gele verwendet (englisch slab gel electrophoresis ‚Gelplatten-Elektrophorese‘).

Literatur Bearbeiten

  • Manfred H. Gey: Instrumentelle Analytik und Bioanalytik. 3. Auflage. Springer, Berlin/ Heidelberg 2015, ISBN 978-3-662-46254-6, Kapitel 8: Elektrophorese, doi:10.1007/978-3-662-46255-3_8.
  • R. E. Offord: Electrophoretic mobilities of peptides on paper and their use in the determination of amide groups. In: Nature. Band 211, Nummer 5049, August 1966, S. 591–593. PMID 5968723.

Weblinks Bearbeiten

Wiktionary: Elektrophorese – Bedeutungserklärungen, Wortherkunft, Synonyme, Übersetzungen

Einzelnachweise Bearbeiten

  1. Eintrag zu electrophoresis. In: IUPAC (Hrsg.): Compendium of Chemical Terminology. The “Gold Book”. doi:10.1351/goldbook.E02022.
  2. V. Knecht, H. J. Risselada, A. E. Mark, S. J. Marrink: Electrophoretic mobility does not always reflect the charge on an oil droplet. In: Journal of Colloid and Interface Science. Band 318, Nr. 2, 15. Januar 2008, S. 477–486, doi:10.1016/j.jcis.2007.10.035 (rug.nl [PDF; abgerufen am 5. Januar 2010]).
  3. Reinhard Kuhn: Capillary Electrophoresis: Principles and Practice. Springer Science & Business Media, 2013, ISBN 978-3-642-78058-5, S. 80.
  4. Reuss, F.F.: Sur un nouvel effet de l'électricité galvanique. In: Mémoires de la Société Impériale des Naturalistes de Moscou. Band II, 1809, S. 327–337.
  5. Arne Tiselius: A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures. In: Transactions of the Faraday Society. Band 33, 1937, S. 524–531, doi:10.1039/TF9373300524.
  6. O. Smithies: Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal adults. In: Biochem. J. Band 61, Nr. 4, 1955, S. 629–641, PMID 13276348, PMC 1215845 (freier Volltext).
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Elektrophorese veraltet Kataphorese bezeichnet die Wanderung geladener kolloidaler Teilchen oder geloster geladener Molekule durch ein elektrisches Feld 1 Elektrophorese mit DNA Fragmenten die uber PCR gewonnen wurden 1 ist der Vater 2 das Kind 3 die Mutter Der Pionier der Elektrophorese war Arne Tiselius 1937 Zum Durchbruch kam die Technik nachdem Oliver Smithies 1955 herausgefunden hatte dass sich Starkegele sehr gut fur die Elektrophorese eigneten spater weitgehend zum Beispiel durch Acrylamid verdrangt Inhaltsverzeichnis 1 Beschreibung 2 Elektrophoretische Mobilitat 3 Warme 4 Arten 5 Anwendung 6 Geschichte 7 Literatur 8 Weblinks 9 EinzelnachweiseBeschreibung BearbeitenDie Driftgeschwindigkeit auch Wanderungsgeschwindigkeit v displaystyle v nbsp der kolloidalen Teilchen typischerweise Proteine oder Nukleinsauren ist bei der Elektrophorese proportional zur Feldstarke E displaystyle E nbsp und zur Ionenladung Q displaystyle Q nbsp umgekehrt proportional zum Teilchenradius r displaystyle r nbsp und zur Viskositat h displaystyle eta nbsp des Stoffes Ausserdem spielt das Ionenmilieu der Losung in dem elektrischer Strom fliesst eine wesentliche Rolle Physikalische Ursache der Bewegung ist die Scherkraft in der elektrischen Doppelschicht die das Kolloid umgibt Stern Doppelschicht und die geladene Flussigkeit in relative Bewegung zum Makromolekul setzt Bei der Gelelektrophorese spielt auch das Verhaltnis zwischen dem Teilchenradius und der Porenweite des als Tragermedium dienenden Gels eine Rolle weil das Gel als Molekularsieb wirkt so dass sich ein grosserer Teilchenradius starker hemmend auf die Wanderungsgeschwindigkeit auswirkt als nur durch die Viskositat allein zu erwarten ware Durch die unterschiedliche Ionenladung und den Teilchenradius bewegen sich die einzelnen Stoffe Molekule unterschiedlich schnell durch das Tragermaterial und erreichen eine Auftrennung entsprechend ihrer elektrophoretischen Mobilitat Damit eignet sich die Elektrophorese sehr gut zur Trennung von Stoffgemischen insbesondere Molekulgemischen Als Tragermaterial konnen Flussigkeiten Gele siehe Gelelektrophorese meistens mit Polyacrylamid oder Agarose oder Feststoffe zum Einsatz kommen Agarose Gele kommen vor allem bei der Auftrennung von DNA Fragmenten zum Einsatz wahrend Proteine meist in Polyacrylamid Gelen aufgetrennt werden Als Verfahren kommen bei Proteinen SDS PAGE und Western Blot zum Einsatz Proteine mussen als Zwitterionen mit zusatzlichen Ladungen durch ein Detergens wie Natriumdodecylsulfat englisch sodium dodecyl sulfate SDS beladen werden um von einer Auftrennung nach den heterogenen Ladungsdichten zu einer Auftrennung nach der Molekulmasse zu kommen Durch Zugabe von SDS und Aufkochen Denaturieren adsorbieren die Proteine proportional zu ihrer aufgefalteten Lange und auch proportional zur Molekulmasse das aliphatische Ende des negativ geladenen Natriumlaurylsulfats Dabei binden circa 1 4 Gramm SDS pro Gramm Protein in einprozentigen SDS Losungen Die negativ geladenen Sulfatgruppen der SDS Molekule stossen sich gegenseitig ab was die Auffaltung Linearisierung der Proteine fordert sofern das Protein keine Disulfidbrucken aufweist Daher werden bei der Molmassenbestimmung zusatzlich Reduktionsmittel zur Uberfuhrung der Disulfide in Thiole hinzugegeben Da mehrere hundert negativ geladene SDS Molekule an die Proteinmolekule binden kann die Eigenladung der Proteine im basischen pH des Gels vernachlassigt werden Elektrophoretische Mobilitat Bearbeiten nbsp Zwei SDS Gele nach dem Ende des Probenlaufs und Farbung der Proteinbanden mit CoomassieDie elektrophoretische Mobilitat von zwei zu trennenden Teilchen muss unterschiedlich sein um eine Trennung mittels Elektrophorese zu erreichen Die elektrophoretische Mobilitat ist die Summe vieler physikalischer Faktoren die letztendlich die Wanderungsgeschwindigkeit eines Teilchens wahrend der Elektrophorese beeinflussen Die generell treibende Kraft die die Bewegung der Teilchen hervorruft ist die Kraft F displaystyle F nbsp die auf ein Teilchen mit bestimmter Ladung q displaystyle q nbsp innerhalb eines elektrischen Feldes mit gegebener Feldstarke E displaystyle E nbsp wirkt F q E displaystyle F q cdot E nbsp Dem entgegen wirkt zunachst eine Kraft die sich durch die Viskositat h displaystyle eta nbsp und die Grosse des Teilchens idealisiert fur spharische Teilchen 6 p r displaystyle 6 cdot pi cdot r nbsp ergibt und nach dem Gesetz von Stokes berechnet werden kann F 6 p r h v displaystyle F 6 cdot pi cdot r cdot eta cdot v nbsp Aus diesen beiden Gleichungen ergibt sich die theoretische elektrophoretische Mobilitat m e p 0 displaystyle mu e p 0 nbsp Theoretisch aus dem Grund da diese beiden Gleichungen nur fur einen idealisierten tragerfreien Zustand mit unendlich verdunntem praktisch salzfreien was jedoch dem Prinzip der Elektrophorese widerspricht da Salzionen als bewegliche Ladungstrager benotigt werden Elektrolyten gelten Weiterhin wird dabei angenommen dass die beschleunigende Kraft der Reibungskraft entspricht und daher eine konstante Wanderungsgeschwindigkeit vorherrscht Daher ergibt sich in diesem Modell die Ionenbeweglichkeit wie folgt m e p 0 v E q 6 p r h displaystyle mu e p 0 frac v E frac q 6 cdot pi cdot r cdot eta nbsp In realen Systemen kommen weitere Faktoren wie die Reibung zwischen den Hydrathullen elektrophoretischer Effekt die Deformation der Ladungsverteilung als Relaxation im elektrischen Feld dissipativer Effekt siehe Ionenatmosphare der Dissoziationsgrad des Elektrolyten und Effekte durch das Tragermaterial Molekularsieb Elektroosmose und Adsorptionseffekte zum Tragen Wahrend traditionelle Theorien davon ausgehen dass elektrophoretische Aktivitat eines Teilchens eine Nettoladung des Teilchens voraussetzt legen neue Ergebnisse aus Molekulardynamiksimulationen nahe dass aufgrund der molekularen Struktur des Wassers an der Oberflache auch ungeladene Teilchen elektrophoretische Aktivitat zeigen konnen 2 Offord fand empirisch folgende Beziehung zwischen der Mobilitat und der Nettoladung Z displaystyle Z nbsp und Molmasse 3 m Z M 2 3 displaystyle mu frac Z M 2 3 nbsp Warme BearbeitenDie maximale anlegbare Spannung wird durch die Erwarmung des Gels begrenzt die durch Reibungseffekte der wandernden Molekule entsteht Die Warme kann zu ungleichmassiger Wanderung der Molekule fuhren vermehrt die Diffusion resultierend in unscharferen Banden und kann die Molekule denaturieren Die Warmeentwicklung wird von der angelegten Spannung und der elektrischen Leitfahigkeit des verwendeten Systems bestimmt insbesondere von der Leitfahigkeit des Elektrophoresepuffers Arten BearbeitenAffinitatselektrophorese Agarose Gelelektrophorese SDD AGE Dichtegradientenelektrophorese tragerfreie Elektrophorese Diskontinuierliche Elektrophorese Elektroosmose tritt bei elektrophoretischen Prozessen auf Elektrofokussierung Free Flow Elektrophorese Gelelektrophorese 2D Gelelektrophorese zweidimensionale Elektrophorese Gradientenelektrophorese Dielektrophorese Immunelektrophorese Isoelektrische Fokussierung tritt bei elektrophoretischen Prozessen auf Kapillarelektrochromatographie Kapillarelektrophorese Lipidelektrophorese Western Blot Isotachophorese Polyacrylamid Gelelektrophorese BAC PAGE CTAB PAGE Nativ PAGE SDS PAGE SDS Polyacrylamidgel Elektrophorese Pulsed Field Gelelektrophorese Serumelektrophorese Uberwanderungselektrophorese ZonenelektrophoreseAnwendung BearbeitenAngewandt wird die Elektrophorese vor allem als Analyseverfahren in der Biologie und Medizin Zu den wichtigsten Anwendungen gehoren die Serumelektrophorese sowie die DNA Analyse in Form von Fragmenten und DNA Sequenzierung Hierbei wird die Moglichkeit genutzt Molekule unterschiedlicher Lange voneinander zu trennen Zur Bestimmung der Messwerte eines Geles wie z B Laufweiten Molmassen Quantifizierungen oder Normalisierung wird eine spezialisierte Auswertesoftware genutzt Auch zur Trennung von Proteinen und fur die hochtechnologischen Verfahren der Proteomforschung bildet die Elektrophorese die Grundlage Die graphische Darstellung der Ergebnisse ist ein Elektropherogramm Neben den analytischen Verfahren werden zur Gewinnung von Milligramm Mengen gereinigter Proteine auch praparative Elektrophoreseverfahren eingesetzt u a Free Flow Elektrophorese Weitere technische Anwendungen Elektronisches Papier Kathodische Tauchlackierung ElektrofiltrationGeschichte BearbeitenElektrophoretische Effekte wurden erstmals 1807 von Pjotr Iwanowitsch Strachow und Ferdinand Friedrich von Reuss untersucht 4 Die Elektrophorese wurde 1937 von Arne Tiselius entwickelt 5 als Methode mit der Kolloide in einer Tragerflussigkeit in einem elektrischen Feld getrennt werden konnten englisch moving boundary electrophoresis Elektrophorese mit beweglicher Grenzschicht Tiselius erhielt dafur 1948 den Nobelpreis fur Chemie In den 1940er Jahren wurden zunehmend feste Phasen zur besseren Trennung verwendet englisch zone electrophoresis Zonenelektrophorese wie das Starkegel von Oliver Smithies 6 oder auch Filterpapier Da diese zur mikrobiellen Zersetzung neigen wurden in Folge auch andere Hydrogele verwendet z B Agarose oder Polyacrylamid Wahrend in den 1950er Jahren oftmals noch eine radiale Elektrophorese auf runden Scheiben durchgefuhrt wurde englisch radial electrophoresis Scheiben Elektrophorese werden heute fast ausschliesslich rechteckige Gele verwendet englisch slab gel electrophoresis Gelplatten Elektrophorese Literatur BearbeitenManfred H Gey Instrumentelle Analytik und Bioanalytik 3 Auflage Springer Berlin Heidelberg 2015 ISBN 978 3 662 46254 6 Kapitel 8 Elektrophorese doi 10 1007 978 3 662 46255 3 8 R E Offord Electrophoretic mobilities of peptides on paper and their use in the determination of amide groups In Nature Band 211 Nummer 5049 August 1966 S 591 593 PMID 5968723 Weblinks Bearbeiten nbsp Wiktionary Elektrophorese Bedeutungserklarungen Wortherkunft Synonyme UbersetzungenEinzelnachweise Bearbeiten Eintrag zu electrophoresis In IUPAC Hrsg Compendium of Chemical Terminology The Gold Book doi 10 1351 goldbook E02022 V Knecht H J Risselada A E Mark S J Marrink Electrophoretic mobility does not always reflect the charge on an oil droplet In Journal of Colloid and Interface Science Band 318 Nr 2 15 Januar 2008 S 477 486 doi 10 1016 j jcis 2007 10 035 rug nl PDF abgerufen am 5 Januar 2010 Reinhard Kuhn Capillary Electrophoresis Principles and Practice Springer Science amp Business Media 2013 ISBN 978 3 642 78058 5 S 80 Reuss F F Sur un nouvel effet de l electricite galvanique In Memoires de la Societe Imperiale des Naturalistes de Moscou Band II 1809 S 327 337 Arne Tiselius A new apparatus for electrophoretic analysis of colloidal mixtures In Transactions of the Faraday Society Band 33 1937 S 524 531 doi 10 1039 TF9373300524 O Smithies Zone electrophoresis in starch gels group variations in the serum proteins of normal adults In Biochem J Band 61 Nr 4 1955 S 629 641 PMID 13276348 PMC 1215845 freier Volltext 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