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Gelelektrophorese Wortteile Gel elektro phorese letzterer abgeleitet von altgriechisch φέρειν pherein tragen ist eine an

Gelelektrophorese

Gelelektrophorese (Wortteile: Gel|elektro|phorese – letzterer abgeleitet von altgriechisch φέρειν pherein ‚tragen‘) ist eine analytische Methode der Chemie und Molekularbiologie, um verschiedene Arten von Molekülen zu trennen.

Versuchsaufbau
Vertikale Gelelektrophoreseapparatur der SDS-PAGE
Horizontale Gelelektrophoreseapparatur der Agarose-Gelelektrophorese

Prinzip Bearbeiten

Die unterschiedliche Ionenbeweglichkeit wird in verschiedenen Elektrophorese-Methoden genutzt, um ionische Substanzen im elektrischen Feld zu trennen und z. B. getrennt einer Messung zuzuführen.

Bei der Gelelektrophorese wandert eine Mischung aus zu trennenden, elektrisch geladenen Molekülen unter Einfluss eines elektrischen Felds durch ein Gel, welches in einer ionischen Pufferlösung (Elektrophoresepuffer) liegt. Je nach Größe und Ladung der Moleküle bewegen sich diese unterschiedlich schnell durch das als Molekularsieb wirkende Gel. Dabei wandern kleine, negativ geladene Moleküle (Anionen) am schnellsten in Richtung der positiv geladenen Anode und positiv geladene Moleküle (Kationen) in Richtung der negativ geladenen Kathode. Die zugrunde liegenden Theorien sind die sich ergänzenden Ogston Siebtheorie und die Reptationstheorie. Während die Siebtheorie das Zurückhalten (synonym Retention) von sphärischen Makromolekülen (z. B. Proteine oder Micellen) durch eine definierte Porosität der Gelmatrix beschreibt, handelt die Reptationstheorie von einer Retention von Makromolekülen durch Reibung nichtsphärischer Makromoleküle an der Gelmatrix (z. B. DNA und RNA).

Gel-Matrix Bearbeiten

Die Polymermoleküle des Gels bilden ein mehr oder weniger engmaschiges, dreidimensionales Gitter, das die Migration (Wanderung) der zu trennenden Moleküle im elektrischen Feld mehr oder weniger verlangsamt.

Agarose Bearbeiten

Agarosegele sind relativ großporig (150 nm bei einprozentigen, 500 nm bei 0,16-prozentigen Gelen) und eignen sich gut zur Trennung von DNA und hochmolekularen Proteinen. Die Distanz zwischen DNA-Banden unterschiedlicher Länge ist abhängig von der Konzentration an Agarose im Gel. Höhere Konzentrationen erfordern längere Laufzeiten (manchmal sogar Tage). Haupteinsatzgebiet ist jedoch die Trennung von Nukleinsäuren. Agarosegele werden aus den natürlichen Polysacchardipolymeren aus Seetang hergestellt. Bei der Elektrophorese mit Agarosegel handelt es sich um ein physikalisches Setting. Nach dem Experiment kann das Ergebnis mithilfe eines Plastikbeutels tiefgekühlt gelagert werden.

Polyacrylamid Bearbeiten

Gele aus Polyacrylamid werden durch Polymerisation von Acrylamid hergestellt. Sie weisen wesentlich kleinere Poren auf (3–6 nm). Die Porengröße hängt von der Acrylamidkonzentration und dem Vernetzungsgrad ab. Häufig werden hiermit Proteine zwischen 5 und 200 kDa getrennt. Man unterscheidet zwischen Trenn- und Sammelgelen.

Stärke Bearbeiten

Eine weitere Möglichkeit bildet die Verwendung von teilweise hydrolysierter Kartoffelstärke in Konzentrationen zwischen 5 % und 10 %. Es handelt sich dabei um ein untoxisches Medium für die Elektrophorese von nicht-denaturierten Proteinen. Die Auftrennung erfolgt nach Größe und Ladung und die Visualisierung erfolgt durch Naphthol-Schwarz- oder Amido-Schwarz-Färbung. Ohne Zugabe von Bioziden neigen Stärkegele zur mikrobiellen Zersetzung.

Durchführung Bearbeiten

Agarose-Gel mit DNA und Lauffarbstoff in den Geltaschen, vor der Elektrophorese.

Die klassische Gelelektrophorese wird als Zonenelektrophorese durchgeführt. Eine Methode zur Erzielung einer höheren Auflösung ist die diskontinuierliche Elektrophorese.

Bei der Gelelektrophorese entsteht Wärme. Diese muss abgeführt werden, um optimale Bedingungen zu gewährleisten. Deswegen sollte die Gelelektrophorese in gekühlten Apparaturen bei konstanten Temperaturen durchgeführt werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.

Im Idealfall wird die Elektrophorese beendet, wenn die kleinsten beziehungsweise mobilsten Moleküle das Ende des Gels erreicht haben. Das garantiert die höchstmögliche Auftrennung der Moleküle.

Auswertung Bearbeiten

Gleiche Moleküle laufen in diskreten Zonen – umgangssprachlich als Banden bezeichnet – durch das Gel. Mehrere Proben können parallel nebeneinander gleichzeitig durch dasselbe Gel laufen. Ist die Größe einiger Moleküle bekannt, kann man durch Vergleich von deren Banden mit den restlichen Banden die Größe der anderen Moleküle abschätzen. Solche Molekülmassenstandards sind kommerziell erhältlich. Ähnlich funktioniert auch ein Komigrationsstandard, mit dessen Hilfe eine unbekannte mit einer bekannten Probenzusammensetzung verglichen wird. Als Molekülmassenstandards werden DNA oder Proteine verwendet.

Eine Bestimmung der Menge einer Substanz in einer Bande beziehungsweise der relative Anteil einer Bande (siehe: Quantifizierung) ist nach der Färbung und Fotografie oder Scan des Gels und einer anschließenden densitometrischen Auswertung möglich, mit der Einschränkung, dass bei sehr dunklen Banden der innere Bereich der Bande mangels Lichteinstrahlung nicht mit gewertet werden kann. Zur Bestimmung der Messwerte eines Geles wie z. B. Laufweiten, Molekülmassen, Quantifizierungen oder Normalisierung wird in den meisten Fällen eine Auswertungssoftware genutzt.

DNA-Banden unter UV-Licht im durch Ethidiumbromid gefärbten Agarose-Gel.

Zur Auswertung des Gels nach der Elektrophorese werden die zu trennenden Moleküle entweder vor der Elektrophorese radioaktiv markiert und anschließend in einer Autoradiographie nachgewiesen oder nach der Elektrophorese mit verschiedenen Farbstoffen versetzt.

Bei der Nukleotidanalytik wird häufig Ethidiumbromid verwendet, das mit Nukleinsäuren interkaliert und diese unter UV-Licht sichtbar macht. Proteine lassen sich mit Proteinfarbstoffen direkt anfärben, z. B. mit Coomassie-Brillant-Blau oder im Zuge der Silberfärbung. Eine Alternative zur Färbung ist das anschließende Blotting. Man unterscheidet:

Einsatzgebiete Bearbeiten

Gelelektrophoresen finden in der Molekularbiologie, Biochemie und Lebensmittelanalytik Anwendung. Gele können ohne großen Aufwand selbst hergestellt werden. Fertige Gele und die entsprechenden Puffersysteme können zudem kommerziell erworben werden.

Es existieren zahlreiche Spezialanwendungen:

Literatur Bearbeiten

  • Friedrich Lottspeich, Haralabos Zorbas: Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg u. a. 1998, ISBN 3-8274-0041-4.
  • Hubert Rehm, Thomas Letzel: Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics. 6. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2010, ISBN 978-3-8274-2312-2.
  • David E. Garfin: One-dimensional gel electrophoresis. In: Methods in Enzymology. Band 182, 1990, S. 425–441, PMID 2314252.
  • David E. Garfin: One-dimensional gel electrophoresis. In: Methods in Enzymology. Band 463, 2009, S. 497–513, doi:10.1016/S0076-6879(09)63029-9, PMID 19892189.

Weblinks Bearbeiten

Commons: Gelelektrophorese – Sammlung von Bildern, Videos und Audiodateien

Einzelnachweise Bearbeiten

  1. Alexander George Ogston: The spaces in a uniform random suspension of fibres. In: Transactions of the Faraday Society. Bd. 54, 1958, ISSN 0014-7672, S. 1754–1757, doi:10.1039/TF9585401754.
  2. Gary W. Slater, Jean Rousseau, Jaan Noolandi, Chantal Turme, Marc Lalande: Quantitative analysis of the three regimes of DNA electrophoresis in agarose gels. In: Biopolymers. Bd. 27, Nr. 3, 1988, ISSN 0006-3525, S. 509–524, PMID 3359012, doi:10.1002/bip.360270311.
  3. Oscar J. Lumpkin, Philippe Déjardin, Bruno H. Zimm: Theory of gel electrophoresis of DNA. In: Biopolymers. Bd. 24, Nr. 8, 1985, S. 1573–1593, PMID 4041551, doi:10.1002/bip.360240812.
  4. Agarose Gel Electrophoresis. Abgerufen am 18. Februar 2015
  5. Joseph Sambrook, David Russell: Molecular Cloning - A Laboratory Manual
  6. Gordon A.H.: Electrophoresis of proteins in polyacrylamide and starch gels. American Elsevier Publishing Company, Inc, New York 1975.
  7. Smithies O.: Zone electrophoresis in starch gels: group variations in the serum proteins of normal adults. In: Biochem. J. Band 61, Nr. 4, 1955, S. 629–641, PMID 13276348, PMC 1215845 (freier Volltext).
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Gelelektrophorese Wortteile Gel elektro phorese letzterer abgeleitet von altgriechisch ferein pherein tragen ist eine analytische Methode der Chemie und Molekularbiologie um verschiedene Arten von Molekulen zu trennen VersuchsaufbauVertikale Gelelektrophoreseapparatur der SDS PAGEHorizontale Gelelektrophoreseapparatur der Agarose Gelelektrophorese Inhaltsverzeichnis 1 Prinzip 2 Gel Matrix 2 1 Agarose 2 2 Polyacrylamid 2 3 Starke 3 Durchfuhrung 4 Auswertung 5 Einsatzgebiete 6 Literatur 7 Weblinks 8 EinzelnachweisePrinzip Bearbeiten Hauptartikel Elektrophorese Die unterschiedliche Ionenbeweglichkeit wird in verschiedenen Elektrophorese Methoden genutzt um ionische Substanzen im elektrischen Feld zu trennen und z B getrennt einer Messung zuzufuhren Bei der Gelelektrophorese wandert eine Mischung aus zu trennenden elektrisch geladenen Molekulen unter Einfluss eines elektrischen Felds durch ein Gel welches in einer ionischen Pufferlosung Elektrophoresepuffer liegt Je nach Grosse und Ladung der Molekule bewegen sich diese unterschiedlich schnell durch das als Molekularsieb wirkende Gel Dabei wandern kleine negativ geladene Molekule Anionen am schnellsten in Richtung der positiv geladenen Anode und positiv geladene Molekule Kationen in Richtung der negativ geladenen Kathode Die zugrunde liegenden Theorien sind die sich erganzenden Ogston Siebtheorie und die Reptationstheorie 1 2 3 Wahrend die Siebtheorie das Zuruckhalten synonym Retention von spharischen Makromolekulen z B Proteine oder Micellen durch eine definierte Porositat der Gelmatrix beschreibt handelt die Reptationstheorie von einer Retention von Makromolekulen durch Reibung nichtspharischer Makromolekule an der Gelmatrix z B DNA und RNA Gel Matrix BearbeitenDie Polymermolekule des Gels bilden ein mehr oder weniger engmaschiges dreidimensionales Gitter das die Migration Wanderung der zu trennenden Molekule im elektrischen Feld mehr oder weniger verlangsamt Agarose Bearbeiten Hauptartikel Agarose Gelelektrophorese Agarosegele sind relativ grossporig 150 nm bei einprozentigen 500 nm bei 0 16 prozentigen Gelen und eignen sich gut zur Trennung von DNA und hochmolekularen Proteinen Die Distanz zwischen DNA Banden unterschiedlicher Lange ist abhangig von der Konzentration an Agarose im Gel Hohere Konzentrationen erfordern langere Laufzeiten manchmal sogar Tage 4 Haupteinsatzgebiet ist jedoch die Trennung von Nukleinsauren Agarosegele werden aus den naturlichen Polysacchardipolymeren aus Seetang hergestellt Bei der Elektrophorese mit Agarosegel handelt es sich um ein physikalisches Setting Nach dem Experiment kann das Ergebnis mithilfe eines Plastikbeutels tiefgekuhlt gelagert werden 5 Polyacrylamid Bearbeiten Hauptartikel Polyacrylamid Gelelektrophorese Gele aus Polyacrylamid werden durch Polymerisation von Acrylamid hergestellt Sie weisen wesentlich kleinere Poren auf 3 6 nm Die Porengrosse hangt von der Acrylamidkonzentration und dem Vernetzungsgrad ab Haufig werden hiermit Proteine zwischen 5 und 200 kDa getrennt Man unterscheidet zwischen Trenn und Sammelgelen Starke Bearbeiten Eine weitere Moglichkeit bildet die Verwendung von teilweise hydrolysierter Kartoffelstarke in Konzentrationen zwischen 5 und 10 Es handelt sich dabei um ein untoxisches Medium fur die Elektrophorese von nicht denaturierten Proteinen Die Auftrennung erfolgt nach Grosse und Ladung und die Visualisierung erfolgt durch Naphthol Schwarz oder Amido Schwarz Farbung 6 7 Ohne Zugabe von Bioziden neigen Starkegele zur mikrobiellen Zersetzung Durchfuhrung Bearbeiten nbsp Agarose Gel mit DNA und Lauffarbstoff in den Geltaschen vor der Elektrophorese Die klassische Gelelektrophorese wird als Zonenelektrophorese durchgefuhrt Eine Methode zur Erzielung einer hoheren Auflosung ist die diskontinuierliche Elektrophorese Bei der Gelelektrophorese entsteht Warme Diese muss abgefuhrt werden um optimale Bedingungen zu gewahrleisten Deswegen sollte die Gelelektrophorese in gekuhlten Apparaturen bei konstanten Temperaturen durchgefuhrt werden um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen Im Idealfall wird die Elektrophorese beendet wenn die kleinsten beziehungsweise mobilsten Molekule das Ende des Gels erreicht haben Das garantiert die hochstmogliche Auftrennung der Molekule Auswertung BearbeitenGleiche Molekule laufen in diskreten Zonen umgangssprachlich als Banden bezeichnet durch das Gel Mehrere Proben konnen parallel nebeneinander gleichzeitig durch dasselbe Gel laufen Ist die Grosse einiger Molekule bekannt kann man durch Vergleich von deren Banden mit den restlichen Banden die Grosse der anderen Molekule abschatzen Solche Molekulmassenstandards sind kommerziell erhaltlich Ahnlich funktioniert auch ein Komigrationsstandard mit dessen Hilfe eine unbekannte mit einer bekannten Probenzusammensetzung verglichen wird Als Molekulmassenstandards werden DNA oder Proteine verwendet Eine Bestimmung der Menge einer Substanz in einer Bande beziehungsweise der relative Anteil einer Bande siehe Quantifizierung ist nach der Farbung und Fotografie oder Scan des Gels und einer anschliessenden densitometrischen Auswertung moglich mit der Einschrankung dass bei sehr dunklen Banden der innere Bereich der Bande mangels Lichteinstrahlung nicht mit gewertet werden kann Zur Bestimmung der Messwerte eines Geles wie z B Laufweiten Molekulmassen Quantifizierungen oder Normalisierung wird in den meisten Fallen eine Auswertungssoftware genutzt nbsp DNA Banden unter UV Licht im durch Ethidiumbromid gefarbten Agarose Gel Zur Auswertung des Gels nach der Elektrophorese werden die zu trennenden Molekule entweder vor der Elektrophorese radioaktiv markiert und anschliessend in einer Autoradiographie nachgewiesen oder nach der Elektrophorese mit verschiedenen Farbstoffen versetzt Bei der Nukleotidanalytik wird haufig Ethidiumbromid verwendet das mit Nukleinsauren interkaliert und diese unter UV Licht sichtbar macht Proteine lassen sich mit Proteinfarbstoffen direkt anfarben z B mit Coomassie Brillant Blau oder im Zuge der Silberfarbung Eine Alternative zur Farbung ist das anschliessende Blotting Man unterscheidet Western Blot immunologischer Nachweis von Proteinen mit markierten Antikorpern Southern Blot Nachweis von DNA durch Hybridisierung mit DNA oder RNA Sonden Northern Blot Nachweis von mRNA ebenfalls durch Hybridisierung mit Nukleotidsonden Einsatzgebiete BearbeitenGelelektrophoresen finden in der Molekularbiologie Biochemie und Lebensmittelanalytik Anwendung Gele konnen ohne grossen Aufwand selbst hergestellt werden Fertige Gele und die entsprechenden Puffersysteme konnen zudem kommerziell erworben werden Es existieren zahlreiche Spezialanwendungen SDS PAGE zur Trennung von Stoffgemischen haufig Proteinen nach Molekulgrosse IEF zur Trennung von Proteinen nach ihrem isoelektrischem Punkt 2D Gelelektrophorese als Kombination aus SDS Page und IEF fur komplexe Proteingemische Diskontinuierliche Elektrophorese Nativ Gelelektrophorese zur Untersuchung der Proteinfaltung SDD AGE zur Untersuchung von Proteinaggregaten Pulsed Field Gelelektrophorese PFGE zur Trennung grosser DNA Fragmente Kapillarelektrophorese CE Literatur BearbeitenFriedrich Lottspeich Haralabos Zorbas Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg u a 1998 ISBN 3 8274 0041 4 Hubert Rehm Thomas Letzel Der Experimentator Proteinbiochemie Proteomics 6 Auflage Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 2010 ISBN 978 3 8274 2312 2 David E Garfin One dimensional gel electrophoresis In Methods in Enzymology Band 182 1990 S 425 441 PMID 2314252 David E Garfin One dimensional gel electrophoresis In Methods in Enzymology Band 463 2009 S 497 513 doi 10 1016 S0076 6879 09 63029 9 PMID 19892189 Weblinks Bearbeiten nbsp Commons Gelelektrophorese Sammlung von Bildern Videos und AudiodateienEinzelnachweise Bearbeiten Alexander George Ogston The spaces in a uniform random suspension of fibres In Transactions of the Faraday Society Bd 54 1958 ISSN 0014 7672 S 1754 1757 doi 10 1039 TF9585401754 Gary W Slater Jean Rousseau Jaan Noolandi Chantal Turme Marc Lalande Quantitative analysis of the three regimes of DNA electrophoresis in agarose gels In Biopolymers Bd 27 Nr 3 1988 ISSN 0006 3525 S 509 524 PMID 3359012 doi 10 1002 bip 360270311 Oscar J Lumpkin Philippe Dejardin Bruno H Zimm Theory of gel electrophoresis of DNA In Biopolymers Bd 24 Nr 8 1985 S 1573 1593 PMID 4041551 doi 10 1002 bip 360240812 Agarose Gel Electrophoresis Abgerufen am 18 Februar 2015 Joseph Sambrook David Russell Molecular Cloning A Laboratory Manual Gordon A H Electrophoresis of proteins in polyacrylamide and starch gels American Elsevier Publishing Company Inc New York 1975 Smithies O Zone electrophoresis in starch gels group variations in the serum proteins of normal adults In Biochem J Band 61 Nr 4 1955 S 629 641 PMID 13276348 PMC 1215845 freier Volltext Abgerufen von https de wikipedia org w index php title Gelelektrophorese amp oldid 238332250