www.wikidata.de-de.nina.az

Fluoreszenzmarkierung Die ist eine Methode der Biochemie zur Markierung von Biomolekülen mit Fluorophoren Fluoreszente M

Fluoreszenzmarkierung

Die Fluoreszenzmarkierung ist eine Methode der Biochemie zur Markierung von Biomolekülen mit Fluorophoren.

Fluoreszente Markierungen verschiedener Proteine.

Prinzip Bearbeiten

Mehrfarbige Markierung verschiedener Neuronen.

Biomoleküle werden gelegentlich zur erleichterten Verfolgung mit fluoreszenten Molekülen versehen. Durch die Kupplung von Fluorophoren an Proteine oder Kohlenhydrate auf der Zelloberfläche können auch Zellen direkt markiert werden oder mit fluoreszenten Immunkonjugaten indirekt nachgewiesen werden, z. B. per Durchflusszytometrie, Fluoreszenzmikroskopie oder Fluoreszenztomographie.

Bei einer Fluoreszenzmarkierung kann das nachzuweisende Molekül direkt mit einem Fluorophor versehen werden oder indirekt durch selektiv bindende fluoreszente Moleküle nachgewiesen werden. Methoden zur Fluoreszenzmarkierung sind:

Proteine Bearbeiten

GFP aus Aequorea victoria.

Bei Proteinen werden in vivo unter anderem das grün fluoreszierende Protein (GFP) als rekombinantes Fusionsprotein oder als Reportergen verwendet. Inteine können zur C-terminalen Markierung von Proteinen eingesetzt werden. Als fluoreszentes Protein-Tag kann auch das Flash-Tag verwendet werden. Mit Redox-abhängigen Fluoreszenten Proteinen wie roGFP, rxYFP und HyPer kann die Fluoreszenz sauerstoffabhängig verändert werden. Mit spannungsabhängigen Proteinen wie VSFP kann die Fluoreszenz durch Anlegen einer elektrischen Spannung verändert werden.

Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
Carboxyfluoresceinsuccinimidylester (CFSE).

Proteine können auch teilsynthetisch (bioorthogonal) markiert werden, in dem reaktive Aminosäurederivate in vivo eingebaut werden, die im Anschluss in vitro mit einem Fluorophor gekuppelt werden. Weiterhin werden Proteine mit verschiedenen chemischen Kupplungsreaktionen in vitro mit unterschiedlichen Fluorophoren versehen. Beispielsweise können nukleophile Gruppen (am häufigsten kommen Aminogruppen in Proteinen vor) durch Reaktionen mit Isothiocyanate (z. B. FITC, TRITC), Succinimidylestern (z. B. CFSE) mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen wie z. B. Fluorescein, Rhodamin und deren Derivate markiert werden. 1-Fluor-2,4-dinitrobenzol und Dansylchlorid reagieren mit Aminogruppen. Cysteine können mit IAEDANS oder Ellmans Reagenz markiert werden. Proteine können auch indirekt durch eine Immunmarkierung mit fluoreszenten Immunkonjugaten nachgewiesen werden, z. B. bei der Fluoreszenzmikroskopie, dem Western Blot und dem Immunoassay. Im Zuge einer Peptidsynthese können Peptide durch Verwendung von fluoreszenten Aminosäurederivaten markiert werden. Durch einen Förster-Resonanzenergietransfer (FRET), Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer (BRET), Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) oder eine Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) kann mit Fluorophoren die Nachbarschaft zweier Proteine nachgewiesen werden.

Nukleinsäuren Bearbeiten

DNA kann bioorthogonal markiert werden. Dazu kann DNA in vivo oder in vitro mit Nukleosidanaloga markiert werden, welche z. B. anschließend per Staudinger-Reaktion mit einem Fluorophor gekuppelt werden können. DNA kann chemisch mit Fluorophoren versehen werden. Oligonukleotide können durch eine Phosphoramidit-Synthese mit Fluorophoren markiert werden, die z. B. in der QPCR, der DNA-Sequenzierung und der In-situ-Hybridisierung verwendet werden. Daneben kann DNA enzymatisch im Zuge einer Polymerasekettenreaktion mit fluoreszenten Nukleotiden erzeugt oder mit einer Ligase oder einer terminalen Desoxynukleotidyltransferase markiert werden. DNA kann indirekt durch eine Biotinylierung und fluoreszentem Avidin nachgewiesen werden. Als Fluorophore werden für Kupplungen unter anderem Fluorescein, fluoreszente Lanthanoide, Gold-Nanopartikel, Kohlenstoffnanoröhren oder Quantenpunkte eingesetzt.

Literatur Bearbeiten

  • F. Borek: The fluorescent antibody method in medical and biological research. In: Bulletin of the World Health Organization. Band 24, Nummer 2, 1961, S. 249–256, PMID 20604086, PMC 2555496 (freier Volltext).

Einzelnachweise Bearbeiten

  1. S. J. Smith: Circuit reconstruction tools today. In: Current opinion in neurobiology. Band 17, Nummer 5, Oktober 2007, S. 601–608, doi:10.1016/j.conb.2007.11.004. PMID 18082394. PMC 2693015 (freier Volltext).
  2. C. P. Toseland: Fluorescent labeling and modification of proteins. In: Journal of chemical biology. Band 6, Nummer 3, April 2013, S. 85–95, doi:10.1007/s12154-013-0094-5. PMID 24432126. PMC 3691395 (freier Volltext).
  3. S. Lindström: Flow cytometry and microscopy as means of studying single cells: a short introductional overview. In: Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). Band 853, 2012, S. 13–15, doi:10.1007/978-1-61779-567-1_2. PMID 22323136.
  4. D. Jung, K. Min, J. Jung, W. Jang, Y. Kwon: Chemical biology-based approaches on fluorescent labeling of proteins in live cells. In: Molecular bioSystems. Band 9, Nummer 5, Mai 2013, S. 862–872, doi:10.1039/c2mb25422k. PMID 23318293.
  5. C. C. Wang, T. S. Seo, Z. Li, H. Ruparel, J. Ju: Site-specific fluorescent labeling of DNA using Staudinger ligation. In: Bioconjugate Chemistry. Band 14, Nummer 3, 2003 May-Jun, S. 697–701, doi:10.1021/bc0256392. PMID 12757398.
  6. ↑ L. J. Kricka, P. Fortina: Analytical ancestry: "firsts" in fluorescent labeling of nucleosides, nucleotides, and nucleic acids. In: Clinical chemistry. Band 55, Nummer 4, April 2009, S. 670–683, doi:10.1373/clinchem.2008.116152. PMID 19233914.
  7. J. M. Prober, G. L. Trainor, R. J. Dam, F. W. Hobbs, C. W. Robertson, R. J. Zagursky, A. J. Cocuzza, M. A. Jensen, K. Baumeister: A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides. In: Science (1987), Band 238(4825), S. 336–41. PMID 2443975.
  8. R. W. Richardson, R. I. Gumport: Biotin and fluorescent labeling of RNA using T4 RNA ligase. In: Nucleic acids research. Band 11, Nummer 18, September 1983, S. 6167–6184, PMID 6194506. PMC 326365 (freier Volltext).
  9. H. Eshaghpour, D. Söll, D. M. Crothers: Specific chemical labeling of DNA fragments. In: Nucleic acids research. Band 7, Nummer 6, November 1979, S. 1485–1495, PMID 228251. PMC 342322 (freier Volltext).
  10. J. Nurmi, T. Wikman, M. Karp, T. Lövgren: High-performance real-time quantitative RT-PCR using lanthanide probes and a dual-temperature hybridization assay. In: Analytical chemistry. Band 74, Nummer 14, Juli 2002, S. 3525–3532, PMID 12139064.
  11. A. Lehmusvuori, A. H. Tapio, P. Mäki-Teeri, K. Rantakokko-Jalava, Q. Wang, H. Takalo, T. Soukka: Homogeneous duplex polymerase chain reaction assay using switchable lanthanide fluorescence probes. In: Analytical biochemistry. Band 436, Nummer 1, Mai 2013, S. 16–21, doi:10.1016/j.ab.2013.01.007. PMID 23353013.
wikipedia, wiki, deutsches, deutschland, buch, bücher, bibliothek artikel lesen, herunterladen kostenlos kostenloser herunterladen, MP3, Video, MP4, 3GP, JPG, JPEG, GIF, PNG, Bild, Musik, Lied, Film, Buch, Spiel, Spiele
Veröffentlichungsdatum:
Die Fluoreszenzmarkierung ist eine Methode der Biochemie zur Markierung von Biomolekulen mit Fluorophoren Fluoreszente Markierungen verschiedener Proteine Inhaltsverzeichnis 1 Prinzip 1 1 Proteine 1 2 Nukleinsauren 2 Literatur 3 EinzelnachweisePrinzip Bearbeiten nbsp Mehrfarbige Markierung verschiedener Neuronen 1 Biomolekule werden gelegentlich zur erleichterten Verfolgung mit fluoreszenten Molekulen versehen 2 Durch die Kupplung von Fluorophoren an Proteine oder Kohlenhydrate auf der Zelloberflache konnen auch Zellen direkt markiert werden oder mit fluoreszenten Immunkonjugaten indirekt nachgewiesen werden 3 z B per Durchflusszytometrie Fluoreszenzmikroskopie oder Fluoreszenztomographie Bei einer Fluoreszenzmarkierung kann das nachzuweisende Molekul direkt mit einem Fluorophor versehen werden oder indirekt durch selektiv bindende fluoreszente Molekule nachgewiesen werden Methoden zur Fluoreszenzmarkierung sind Direkte Molekulnachweise chemische Kupplung nur in vitro bioorthogonale Markierung fluoreszente Reportermolekule fluoreszente Protein Tags Protein Tags mit Fluorophorkupplung Flash Tag bzw RNA Tags Indirekte Molekulnachweise Immunmarkierung Hybridisierungssonden BiotinylierungProteine Bearbeiten nbsp GFP aus Aequorea victoria Bei Proteinen werden in vivo unter anderem das grun fluoreszierende Protein GFP als rekombinantes Fusionsprotein oder als Reportergen verwendet 4 Inteine konnen zur C terminalen Markierung von Proteinen eingesetzt werden Als fluoreszentes Protein Tag kann auch das Flash Tag verwendet werden Mit Redox abhangigen Fluoreszenten Proteinen wie roGFP rxYFP und HyPer kann die Fluoreszenz sauerstoffabhangig verandert werden Mit spannungsabhangigen Proteinen wie VSFP kann die Fluoreszenz durch Anlegen einer elektrischen Spannung verandert werden nbsp Fluoresceinisothiocyanat FITC nbsp Carboxyfluoresceinsuccinimidylester CFSE Proteine konnen auch teilsynthetisch bioorthogonal markiert werden in dem reaktive Aminosaurederivate in vivo eingebaut werden die im Anschluss in vitro mit einem Fluorophor gekuppelt werden Weiterhin werden Proteine mit verschiedenen chemischen Kupplungsreaktionen in vitro mit unterschiedlichen Fluorophoren versehen Beispielsweise konnen nukleophile Gruppen am haufigsten kommen Aminogruppen in Proteinen vor durch Reaktionen mit Isothiocyanate z B FITC TRITC Succinimidylestern z B CFSE mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen wie z B Fluorescein Rhodamin und deren Derivate markiert werden 1 Fluor 2 4 dinitrobenzol und Dansylchlorid reagieren mit Aminogruppen Cysteine konnen mit IAEDANS oder Ellmans Reagenz markiert werden Proteine konnen auch indirekt durch eine Immunmarkierung mit fluoreszenten Immunkonjugaten nachgewiesen werden z B bei der Fluoreszenzmikroskopie dem Western Blot und dem Immunoassay Im Zuge einer Peptidsynthese konnen Peptide durch Verwendung von fluoreszenten Aminosaurederivaten markiert werden Durch einen Forster Resonanzenergietransfer FRET Biolumineszenz Resonanzenergietransfer BRET Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie FCS oder eine Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation BiFC kann mit Fluorophoren die Nachbarschaft zweier Proteine nachgewiesen werden Nukleinsauren Bearbeiten DNA kann bioorthogonal markiert werden Dazu kann DNA in vivo oder in vitro mit Nukleosidanaloga markiert werden welche z B anschliessend per Staudinger Reaktion mit einem Fluorophor gekuppelt werden konnen 5 DNA kann chemisch mit Fluorophoren versehen werden 6 Oligonukleotide konnen durch eine Phosphoramidit Synthese mit Fluorophoren markiert werden die z B in der QPCR der DNA Sequenzierung und der In situ Hybridisierung verwendet werden Daneben kann DNA enzymatisch im Zuge einer Polymerasekettenreaktion mit fluoreszenten Nukleotiden erzeugt oder mit einer Ligase oder einer terminalen Desoxynukleotidyltransferase markiert werden 7 8 9 DNA kann indirekt durch eine Biotinylierung und fluoreszentem Avidin nachgewiesen werden Als Fluorophore werden fur Kupplungen unter anderem Fluorescein fluoreszente Lanthanoide 10 11 Gold Nanopartikel Kohlenstoffnanorohren oder Quantenpunkte eingesetzt 6 Literatur BearbeitenF Borek The fluorescent antibody method in medical and biological research In Bulletin of the World Health Organization Band 24 Nummer 2 1961 S 249 256 PMID 20604086 PMC 2555496 freier Volltext Einzelnachweise Bearbeiten S J Smith Circuit reconstruction tools today In Current opinion in neurobiology Band 17 Nummer 5 Oktober 2007 S 601 608 doi 10 1016 j conb 2007 11 004 PMID 18082394 PMC 2693015 freier Volltext C P Toseland Fluorescent labeling and modification of proteins In Journal of chemical biology Band 6 Nummer 3 April 2013 S 85 95 doi 10 1007 s12154 013 0094 5 PMID 24432126 PMC 3691395 freier Volltext S Lindstrom Flow cytometry and microscopy as means of studying single cells a short introductional overview In Methods in molecular biology Clifton N J Band 853 2012 S 13 15 doi 10 1007 978 1 61779 567 1 2 PMID 22323136 D Jung K Min J Jung W Jang Y Kwon Chemical biology based approaches on fluorescent labeling of proteins in live cells In Molecular bioSystems Band 9 Nummer 5 Mai 2013 S 862 872 doi 10 1039 c2mb25422k PMID 23318293 C C Wang T S Seo Z Li H Ruparel J Ju Site specific fluorescent labeling of DNA using Staudinger ligation In Bioconjugate Chemistry Band 14 Nummer 3 2003 May Jun S 697 701 doi 10 1021 bc0256392 PMID 12757398 a b L J Kricka P Fortina Analytical ancestry firsts in fluorescent labeling of nucleosides nucleotides and nucleic acids In Clinical chemistry Band 55 Nummer 4 April 2009 S 670 683 doi 10 1373 clinchem 2008 116152 PMID 19233914 J M Prober G L Trainor R J Dam F W Hobbs C W Robertson R J Zagursky A J Cocuzza M A Jensen K Baumeister A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain terminating dideoxynucleotides In Science 1987 Band 238 4825 S 336 41 PMID 2443975 R W Richardson R I Gumport Biotin and fluorescent labeling of RNA using T4 RNA ligase In Nucleic acids research Band 11 Nummer 18 September 1983 S 6167 6184 PMID 6194506 PMC 326365 freier Volltext H Eshaghpour D Soll D M Crothers Specific chemical labeling of DNA fragments In Nucleic acids research Band 7 Nummer 6 November 1979 S 1485 1495 PMID 228251 PMC 342322 freier Volltext J Nurmi T Wikman M Karp T Lovgren High performance real time quantitative RT PCR using lanthanide probes and a dual temperature hybridization assay In Analytical chemistry Band 74 Nummer 14 Juli 2002 S 3525 3532 PMID 12139064 A Lehmusvuori A H Tapio P Maki Teeri K Rantakokko Jalava Q Wang H Takalo T Soukka Homogeneous duplex polymerase chain reaction assay using switchable lanthanide fluorescence probes In Analytical biochemistry Band 436 Nummer 1 Mai 2013 S 16 21 doi 10 1016 j ab 2013 01 007 PMID 23353013 Normdaten Sachbegriff GND 4154829 2 lobid OGND AKS Abgerufen von https de wikipedia org w index php title Fluoreszenzmarkierung amp oldid 220732158