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Channelrhodopsin e deutsch auch Kanalrhodopsine sind Ionenkanäle die in der Zellmembran bestimmter einzelliger Algen vor

Channelrhodopsin

Channelrhodopsine (deutsch auch: Kanalrhodopsine) sind Ionenkanäle, die in der Zellmembran bestimmter einzelliger Algen vorkommen. Blaues Licht führt zur Öffnung dieser Kanäle (engl. light-gated) und zum Einstrom von Ionen in die Zelle. Durch Channelrhodopsine wird das Membranpotential und die Ionenkonzentration im Cytosol von der Lichtintensität abhängig. Wird ein Gen für Channelrhodopsin in Nervenzellen eingeschleust, kann die elektrische Erregbarkeit dieser Nervenzellen durch Lichtpulse kontrolliert werden (Optogenetik).

Channelrhodopsin
Bezeichner
Gen-Name(n) ChR1, ChR2, VChR1
Transporter-Klassifikation
TCDB 3.E.1.7
Bezeichnung ionenverschiebendes mikrobielles Rhodopsin
Vorkommen
Übergeordnetes Taxon Algen

Die ersten Channelrhodopsine, die entdeckt wurden, Channelrhodopsin-1 (ChR1) und Channelrhodopsin-2 (ChR2), dienen Grünalgen der Gattung Chlamydomonas als sensorische Photorezeptoren. Sie leiten positiv geladenen Ionen (Kationen) in die Zelle und steuern damit negative und positive phototaxische Reaktionen bei hohem Lichteinfall. VChR1 wurde in der vielzelligen Alge Volvox gefunden; sein Absorptionsmaximum liegt bei einer höheren Wellenlänge als ChR1 und ChR2. Es zeigt aber eine Übereinstimmung der Aminosäuresequenz von 80 % zur ChR1-Gruppe, wodurch diese Proteine als homolog zueinander betrachtet werden. Neben diesen kationen-leitenden Channelrhodopsinen wurden in cryptophyten Algen Channelrhodopsine gefunden, die negativ geladene Ionen (Anionen) leiten. Werden anionenleitende Channelrhodopsine (engl. ACR) in Nervenzellen eingeschleust, können diese Nervenzellen durch Beleuchtung an der Aktivierung gehindert werden (engl. silencing).

Aufbau und Funktion Bearbeiten

Channelrhodopsine (ChR) sind, wie andere Rhodopsine auch, Proteine mit sieben helikalen Transmembrandomänen und einem Retinal-Chromophor, der als protonierte Schiffsche Base kovalent an das Protein gebunden ist. Das Absorptionsmaximum von ChR2 liegt mit ungefähr 460–470 nm im Blauen. Sobald das all-trans-Retinal im Protein-Retinal-Komplex Licht absorbiert, isomerisiert es zu einem 13-cis-Retinal und verursacht dadurch eine Konformationsänderung des Proteins. Diese führt zum Öffnen der Pore im Protein, ihr Durchmesser beträgt mindestens 0,6 nm. Das 13-cis-Retinal relaxiert nach einiger Zeit zurück zum all-trans-Retinal, wodurch sich die Pore wieder schließt und der Ionenfluss unterbrochen wird. Während die meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (darunter Rhodopsin) Ionenkanäle indirekt mittels sekundärer Botenstoffe öffnen, bildet bei den Channelrhodopsinen das Protein selbst eine Pore. Dieser Aufbau ermöglicht eine sehr schnelle und zuverlässige Depolarisation der Zelle. Bei heterologer Expression von ChR2 in Nervenzellen kann durch einen kurzen Lichtpuls (1–2 ms) ein Aktionspotential ausgelöst werden. In den meisten Zelltypen ist hinreichend Retinal (Vitamin A) vorhanden, um die Produktion funktionsfähiger Channelrhodopsine ohne Zusatz von Retinal zu ermöglichen.

Varianten für die Anwendung in optogentischen Experimenten Bearbeiten

Der Austausch von Aminosäuren nahe der retinalen Bindungstasche (Punktmutation) beeinflusst die biophysikalischen Eigenschaften von Channelrhodopsin. Verschiedene Arbeitsgruppen haben durch gezielte Mutationen eine Vielzahl von optogenetischen Werkzeugen generiert.

Kinetik Bearbeiten

Das Schließen des Kanals nach der optischen Aktivierung kann durch Mutation der Proteinreste C128 oder D156 wesentlich verzögert werden. Diese Modifikation führt zu hochempfindlichen Channelrhodopsinen, die durch einen blauen Lichtimpuls geöffnet und durch einen grünen oder gelben Lichtimpuls geschlossen werden können (Step-function opsins). Die Mutation des E123-Restes beschleunigt die Kanalkinetik (ChETA), und die resultierenden ChR2-Mutanten wurden verwendet, um Neuronen mit bis zu 200 Hz feuern zu lassen. Im Allgemeinen sind Channelrhodopsine mit langsamer Kinetik auf der Populationsebene lichtempfindlicher, da offene Kanäle im Laufe der Zeit auch bei niedrigen Lichtpegeln akkumulieren.

Photostrom-Amplitude Bearbeiten

H134R- und T159C-Mutanten zeigen erhöhte Photoströme; eine Kombination von T159 und E123 (ET/TC) hat etwas größere Photoströme und eine etwas schnellere Kinetik als Wildtyp-ChR2. Unter ChR-Varianten zeigt ChIEF, eine Chimäre und Punktmutante von ChR1 und ChR2, die größten Photoströme und die geringste Desensibilisierung und besitzt eine Kinetik, die ChR2 ähnelt.

Anregungswellenlänge Bearbeiten

Chimäre Channelrhodopsine wurden durch Kombination von Transmembran-Helices aus ChR1 und VChR1 entwickelt, was zu ChRs mit roten Spektralverschiebungen führte (z. B. C1V1, ReaChR). ReaChR kann in Säugetierzellen mit sehr hoher Dichte in die Zellmembran eingebaut werden und wurde für die minimalinvasive, transkranielle Aktivierung von Hirnstamm-Motoneuronen eingesetzt. Die Suche nach homologen Sequenzen in anderen Organismen führte zu spektral verbesserten und stärker rotverschobenen Channelrhodopsinen (z. B. ChrimsonR). In Kombination mit ChR2 ermöglichen diese gelb- / rotlichtempfindlichen Channelrhodopsine die Kontrolle von zwei Populationen von Neuronen unabhängig voneinander mit Lichtpulsen unterschiedlicher Farben. Ein blauverschobenes Channelrhodopsin wurde in der Alge Scherffelia dubia entdeckt. Nach einigen Mutationen zur Verbesserung des Membranhandels und der Geschwindigkeit führte das resultierende Werkzeug (CheRiff) zu großen Photoströmen bei Anregung durch blaues Licht (460 nm).

Ionenselektivität Bearbeiten

Die L132C-Mutation (CatCh) erhöht die Permeabilität für Calciumionen und erzeugt sehr große Ströme, wobei die vierfache Punktmutante CapChR1 die Kalziumleitfähigkeit weiter erhöht. Die Mutation von E90 zur positiv geladenen Aminosäure Arginin verwandelt Channelrhodopsin von einem unspezifischen Kationenkanal in einen Chlorid-leitenden Kanal (ChloC). Die Selektivität für Cl- wurde durch Ersetzen negativ geladener Reste in der Pore des Kanals weiter verbessert. Selektive Chlorid-leitende Channelrhodopsine (iChloC, GtACR) werden benutzt, um die Aktivität bestimmter Neurone in der Taufliege und in der Maus gezielt zu dämpfen und so die Funktion dieser Neurone für ein bestimmtes Verhalten zu untersuchen.

Anwendungen in der Forschung Bearbeiten

Schematische Darstellung eines ChR2-RFP-Fusionsproteins. RFP ist ein rot fluoreszierendes Protein, das ähnlich wie GFP zur Markierung von Zellstrukturen eingesetzt werden kann.

Während der N-Terminus die sieben Transmembrandomänen einschließt, reicht das C-terminale Ende des ChR2-Proteins in den Intrazellularraum hinein und kann ersetzt oder verändert werden, ohne dass die Funktion des Proteins als Ionenkanal beeinträchtigt wird. Channelrhodopsine können mit einer Reihe von Transfektionstechniken (virale Transfektion, Elektroporation, Genkanone) in erregbaren Zellen wie Neuronen exprimiert (produziert) werden. Vitamin-A, die Vorstufe des lichtabsorbierenden Chromophors Retinal ist in Wirbeltier-Zellen meist schon vorhanden, so dass sich erregbare Zellen, die ein Channelrhodopsin exprimieren, durch Beleuchtung einfach depolarisieren lassen.

Aufgrund dieser Eigenschaften interessieren sich Biotechnik und Neurowissenschaften für den Einsatz von Channelrhodopsinen, beispielsweise für Anwendungen wie die Photostimulation von Neuronen. Das blauempfindliche ChR2 in Kombination mit der durch Gelblicht-aktiviertierbaren Chloridpumpe Halorhodopsin erlauben das An- und Abschalten der neuronalen Aktivität innerhalb von Millisekunden. Das neu entstehende Fachgebiet, das sich mit der Kontrolle von genetisch modifizierten Zellen mittels Licht beschäftigt, wird als Optogenetik bezeichnet.

Wird ChR2 mit einem Fluoreszenzlabel markiert, können durch Licht angeregte Axone und Synapsen im intakten Gehirngewebe identifiziert werden. Diese Technik lässt sich zur Aufklärung der molekularen Ereignisse während der Induktion synaptischer Plastizität einsetzen. Mit Hilfe von ChR2 wurden weit reichende neuronale Bahnen im Gehirn kartiert.

Dass sich das Verhalten transgener Tiere, die ChR2 in einem Anteil ihrer Neuronen exprimieren, durch intensive Beleuchtung mit Blaulicht berührungslos kontrollieren lässt, wurde bereits für Nematoden, Taufliegen, Zebrafische und Mäuse gezeigt.

Die Sehfunktion blinder Mäuse konnte durch Expression von ChR2 in Bipolarzellen der Netzhaut im Auge teilweise wiederhergestellt werden. Vorstellbar ist auch eine zukünftige medizinische Verwendung von ChR2 bei bestimmten Formen der retinalen Degeneration oder zur Stimulation tief liegender Gehirnabschnitte.

Inzwischen wurden im Rahmen der pflanzlichen Optogenetikforschung sowohl ChR2, als auch ACR, erfolgreich in Modellpflanzen etabliert. Dies bietet völlig neue Möglichkeiten pflanzliche Signaltransduktionsprozesse zu untersuchen. Durch die Etablierung von ChR2 in Arabidopsis thailana wurde es z. B. möglich neue Erkenntnisse im Bereich der Erzeugung elektrischer Signale in Pflanzen zu erzielen.

Einzelnachweise Bearbeiten

  1. Georg Nagel, Doris Ollig, Markus Fuhrmann, Suneel Kateriya, Anna Maria Musti: Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae. In: Science. Band 296, Nr. 5577, 28. Juni 2002, ISSN 0036-8075, S. 2395–2398, doi:10.1126/science.1072068, PMID 12089443 (sciencemag.org [abgerufen am 28. Dezember 2017]).
  2. Zhang F, Prigge M, Beyrière F, et al: Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox carteri. In: Nat. Neurosci. 11. Jahrgang, Nr. 6, 23. April 2008, S. 631–3, doi:10.1038/nn.2120, PMID 18432196.
  3. Elena G. Govorunova, Oleg A. Sineshchekov, Roger Janz, Xiaoqin Liu, John L. Spudich: Natural light-gated anion channels: A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics. In: Science. Band 349, Nr. 6248, 7. August 2015, ISSN 0036-8075, S. 647–650, doi:10.1126/science.aaa7484, PMID 26113638 (sciencemag.org [abgerufen am 28. Dezember 2017]).
  4. Nagel G, Szellas T, Huhn W, et al: Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100. Jahrgang, Nr. 24, 25. November 2003, S. 13940–5, doi:10.1073/pnas.1936192100, PMID 14615590, PMC 283525 (freier Volltext).
  5. André Berndt, Ofer Yizhar, Lisa A Gunaydin, Peter Hegemann, Karl Deisseroth: Bi-stable neural state switches. In: Nature Neuroscience. Band 12, Nr. 2, S. 229–234.
  6. Lisa A Gunaydin, Ofer Yizhar, André Berndt, Vikaas S Sohal, Karl Deisseroth: Ultrafast optogenetic control. In: Nature Neuroscience. Band 13, Nr. 3, S. 387–392.
  7. André Berndt, Philipp Schoenenberger, Joanna Mattis, Kay M. Tye, Karl Deisseroth: High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 108, Nr. 18, 3. Mai 2011, ISSN 1091-6490, S. 7595–7600, doi:10.1073/pnas.1017210108, PMID 21504945, PMC 3088623 (freier Volltext).
  8. John Y. Lin: A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. In: Experimental Physiology. Band 96, Nr. 1, 1. Januar 2011, ISSN 1469-445X, S. 19–25, doi:10.1113/expphysiol.2009.051961, PMID 20621963, PMC 2995811 (freier Volltext).
  9. John Y Lin, Per Magne Knutsen, Arnaud Muller, David Kleinfeld, Roger Y Tsien: ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. In: Nature Neuroscience. Band 16, Nr. 10, September 2013, S. 1499–1508, doi:10.1038/nn.3502, PMID 23995068, PMC 3793847 (freier Volltext).
  10. Nathan C. Klapoetke, Yasunobu Murata, Sung Soo Kim, Stefan R. Pulver, Amanda Birdsey-Benson: Independent optical excitation of distinct neural populations. In: Nature Methods. Band 11, Nr. 3, 1. März 2014, ISSN 1548-7105, S. 338–346, doi:10.1038/nmeth.2836, PMID 24509633, PMC 3943671 (freier Volltext).
  11. Sonja Kleinlogel, Katrin Feldbauer, Robert E Dempski, Heike Fotis, Phillip G Wood: Ultra light-sensitive and fast neuronal activation with the Ca2+-permeable channelrhodopsin CatCh. In: Nature Neuroscience. Band 14, Nr. 4, 13. März 2011, S. 513–518, doi:10.1038/nn.2776.
  12. Rodrigo G. Fernandez Lahore, Niccolò P. Pampaloni, Enrico Peter, M.-Marcel Heim, Linda Tillert, Johannes Vierock, Johannes Oppermann, Jakob Walther, Dietmar Schmitz, David Owald, Andrew J. R. Plested, Benjamin R. Rost, Peter Hegemann: Calcium-permeable channelrhodopsins for the photocontrol of calcium signalling. In: Nature Communications. Band 13, Nr. 1, 21. Dezember 2022, ISSN 2041-1723, S. 7844, doi:10.1038/s41467-022-35373-4 (nature.com [abgerufen am 3. März 2023]).
  13. Jonas Wietek, J. Simon Wiegert, Nona Adeishvili, Franziska Schneider, Hiroshi Watanabe: Conversion of Channelrhodopsin into a Light-Gated Chloride Channel. In: Science. Band 344, Nr. 6182, 25. April 2014, ISSN 0036-8075, S. 409–412, doi:10.1126/science.1249375, PMID 24674867 (sciencemag.org [abgerufen am 16. Januar 2017]).
  14. Jonas Wietek, Riccardo Beltramo, Massimo Scanziani, Peter Hegemann, Thomas G. Oertner: An improved chloride-conducting channelrhodopsin for light-induced inhibition of neuronal activity in vivo. In: Scientific Reports. Band 5, 7. Oktober 2015, ISSN 2045-2322, doi:10.1038/srep14807, PMID 26443033, PMC 4595828 (freier Volltext).
  15. Naoya Takahashi, Thomas G. Oertner, Peter Hegemann, Matthew E. Larkum: Active cortical dendrites modulate perception. In: Science (New York, N.Y.). Band 354, Nr. 6319, 23. Dezember 2016, ISSN 1095-9203, S. 1587–1590, doi:10.1126/science.aah6066, PMID 28008068.
  16. Zhang F, Wang LP, Brauner M, et al: Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. In: Nature. 446. Jahrgang, Nr. 7136, 5. April 2007, S. 633–9, doi:10.1038/nature05744, PMID 17410168.
  17. Zhang YP, Oertner TG: Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel. In: Nat. Methods. 4. Jahrgang, Nr. 2, 4. Februar 2007, S. 139–41, doi:10.1038/nmeth988, PMID 17195846.
  18. Zhang YP, Holbro N, Oertner TG: Optical induction of plasticity at single synapses reveals input-specific accumulation of αCaMKII. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105. Jahrgang, 19. August 2008, S. 12039–44, doi:10.1073/pnas.0802940105, PMID 18697934.
  19. Petreanu L, Huber D, Sobczyk A, Svoboda K: Channelrhodopsin-2–assisted circuit mapping of long-range callosal projections. In: Nat. Neurosci. 10. Jahrgang, Nr. 5, 1. Mai 2007, S. 663–8, doi:10.1038/nn1891, PMID 17435752.
  20. Douglass AD, Kraves S, Deisseroth K, Schier AF, Engert F: Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. In: Current Biology. 18. Jahrgang, Nr. 15, 5. August 2008, S. 1133–1137, PMID 18682213.
  21. Huber D, Petreanu L, Ghitani N, Ranade S, Hromádka T, Mainen Z, Svoboda K: Sparse optical microstimulation in barrel cortex drives learned behaviour in freely moving mice. In: Nature. 451. Jahrgang, Nr. 7174, 3. Januar 2008, S. 61–64, PMID 18094685.
  22. Lagali PS, Balya D, Awatramani GB, et al: Light-activated channels targeted to ON bipolar cells restore visual function in retinal degeneration. In: Nat. Neurosci. 11. Jahrgang, Nr. 6, 1. Juni 2008, S. 667–75, doi:10.1038/nn.2117, PMID 18432197.
  23. ↑ Antonella Reyer, Melanie Häßler, Sönke Scherzer, Shouguang Huang, Jesper Torbøl Pedersen: Channelrhodopsin-mediated optogenetics highlights a central role of depolarization-dependent plant proton pumps. In: Proceedings of the National Academy of Sciences. Band 117, Nr. 34, 25. August 2020, S. 20920–20925, doi:10.1073/pnas.2005626117, PMID 32788371, PMC 7456130 (freier Volltext) – (pnas.org [abgerufen am 22. September 2021]).
  24. Yang Zhou, Meiqi Ding, Shiqiang Gao, Jing Yu-Strzelczyk, Markus Krischke: Optogenetic control of plant growth by a microbial rhodopsin. In: Nature Plants. Band 7, Nr. 2, Februar 2021, ISSN 2055-0278, S. 144–151, doi:10.1038/s41477-021-00853-w (nature.com [abgerufen am 22. September 2021]).
  25. Shouguang Huang, Meiqi Ding, M. Rob G. Roelfsema, Ingo Dreyer, Sönke Scherzer: Optogenetic control of the guard cell membrane potential and stomatal movement by the light-gated anion channel GtACR1. In: Science Advances. Juli 2021, doi:10.1126/sciadv.abg4619, PMID 34244145, PMC 8270491 (freier Volltext).

Literatur Bearbeiten

  • Arenkiel BR, Peca J, Davison IG, et al: In vivo light-induced activation of neural circuitry in transgenic mice expressing channelrhodopsin-2. In: Neuron. 54. Jahrgang, Nr. 2, April 2007, S. 205–18, doi:10.1016/j.neuron.2007.03.005, PMID 17442243. (Einsatz Channelrhodopsin in transgenen Mäusen zur Erforschung der neuronalen Verschaltung im Gehirn)
  • Bi A, Cui J, Ma YP, et al: Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration. In: Neuron. 50. Jahrgang, Nr. 1, April 2006, S. 23–33, doi:10.1016/j.neuron.2006.02.026, PMID 16600853, PMC 1459045 (freier Volltext). (Channelrhodopsin als mögliche Behandlung von Blindheit)

Weblinks Bearbeiten

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Channelrhodopsine deutsch auch Kanalrhodopsine sind Ionenkanale die in der Zellmembran bestimmter einzelliger Algen vorkommen Blaues Licht fuhrt zur Offnung dieser Kanale engl light gated und zum Einstrom von Ionen in die Zelle Durch Channelrhodopsine wird das Membranpotential und die Ionenkonzentration im Cytosol von der Lichtintensitat abhangig Wird ein Gen fur Channelrhodopsin in Nervenzellen eingeschleust kann die elektrische Erregbarkeit dieser Nervenzellen durch Lichtpulse kontrolliert werden Optogenetik ChannelrhodopsinBezeichnerGen Name n ChR1 ChR2 VChR1Transporter KlassifikationTCDB 3 E 1 7Bezeichnung ionenverschiebendes mikrobielles RhodopsinVorkommenUbergeordnetes Taxon AlgenDie ersten Channelrhodopsine die entdeckt wurden Channelrhodopsin 1 ChR1 und Channelrhodopsin 2 ChR2 dienen Grunalgen der Gattung Chlamydomonas als sensorische Photorezeptoren 1 Sie leiten positiv geladenen Ionen Kationen in die Zelle und steuern damit negative und positive phototaxische Reaktionen bei hohem Lichteinfall VChR1 wurde in der vielzelligen Alge Volvox gefunden sein Absorptionsmaximum liegt bei einer hoheren Wellenlange als ChR1 und ChR2 Es zeigt aber eine Ubereinstimmung der Aminosauresequenz von 80 zur ChR1 Gruppe wodurch diese Proteine als homolog zueinander betrachtet werden 2 Neben diesen kationen leitenden Channelrhodopsinen wurden in cryptophyten Algen Channelrhodopsine gefunden die negativ geladene Ionen Anionen leiten 3 Werden anionenleitende Channelrhodopsine engl ACR in Nervenzellen eingeschleust konnen diese Nervenzellen durch Beleuchtung an der Aktivierung gehindert werden engl silencing Inhaltsverzeichnis 1 Aufbau und Funktion 2 Varianten fur die Anwendung in optogentischen Experimenten 2 1 Kinetik 2 2 Photostrom Amplitude 2 3 Anregungswellenlange 2 4 Ionenselektivitat 3 Anwendungen in der Forschung 4 Einzelnachweise 5 Literatur 6 WeblinksAufbau und Funktion BearbeitenChannelrhodopsine ChR sind wie andere Rhodopsine auch Proteine mit sieben helikalen Transmembrandomanen und einem Retinal Chromophor der als protonierte Schiffsche Base kovalent an das Protein gebunden ist Das Absorptionsmaximum von ChR2 liegt mit ungefahr 460 470 nm im Blauen Sobald das all trans Retinal im Protein Retinal Komplex Licht absorbiert isomerisiert es zu einem 13 cis Retinal und verursacht dadurch eine Konformationsanderung des Proteins Diese fuhrt zum Offnen der Pore im Protein ihr Durchmesser betragt mindestens 0 6 nm Das 13 cis Retinal relaxiert nach einiger Zeit zuruck zum all trans Retinal wodurch sich die Pore wieder schliesst und der Ionenfluss unterbrochen wird 4 Wahrend die meisten G Protein gekoppelten Rezeptoren darunter Rhodopsin Ionenkanale indirekt mittels sekundarer Botenstoffe offnen bildet bei den Channelrhodopsinen das Protein selbst eine Pore Dieser Aufbau ermoglicht eine sehr schnelle und zuverlassige Depolarisation der Zelle Bei heterologer Expression von ChR2 in Nervenzellen kann durch einen kurzen Lichtpuls 1 2 ms ein Aktionspotential ausgelost werden In den meisten Zelltypen ist hinreichend Retinal Vitamin A vorhanden um die Produktion funktionsfahiger Channelrhodopsine ohne Zusatz von Retinal zu ermoglichen Varianten fur die Anwendung in optogentischen Experimenten BearbeitenDer Austausch von Aminosauren nahe der retinalen Bindungstasche Punktmutation beeinflusst die biophysikalischen Eigenschaften von Channelrhodopsin Verschiedene Arbeitsgruppen haben durch gezielte Mutationen eine Vielzahl von optogenetischen Werkzeugen generiert Kinetik Bearbeiten Das Schliessen des Kanals nach der optischen Aktivierung kann durch Mutation der Proteinreste C128 oder D156 wesentlich verzogert werden Diese Modifikation fuhrt zu hochempfindlichen Channelrhodopsinen die durch einen blauen Lichtimpuls geoffnet und durch einen grunen oder gelben Lichtimpuls geschlossen werden konnen Step function opsins 5 Die Mutation des E123 Restes beschleunigt die Kanalkinetik ChETA und die resultierenden ChR2 Mutanten wurden verwendet um Neuronen mit bis zu 200 Hz feuern zu lassen 6 Im Allgemeinen sind Channelrhodopsine mit langsamer Kinetik auf der Populationsebene lichtempfindlicher da offene Kanale im Laufe der Zeit auch bei niedrigen Lichtpegeln akkumulieren Photostrom Amplitude Bearbeiten H134R und T159C Mutanten zeigen erhohte Photostrome eine Kombination von T159 und E123 ET TC hat etwas grossere Photostrome und eine etwas schnellere Kinetik als Wildtyp ChR2 7 Unter ChR Varianten zeigt ChIEF eine Chimare und Punktmutante von ChR1 und ChR2 die grossten Photostrome und die geringste Desensibilisierung und besitzt eine Kinetik die ChR2 ahnelt 8 Anregungswellenlange Bearbeiten Chimare Channelrhodopsine wurden durch Kombination von Transmembran Helices aus ChR1 und VChR1 entwickelt was zu ChRs mit roten Spektralverschiebungen fuhrte z B C1V1 ReaChR 9 ReaChR kann in Saugetierzellen mit sehr hoher Dichte in die Zellmembran eingebaut werden und wurde fur die minimalinvasive transkranielle Aktivierung von Hirnstamm Motoneuronen eingesetzt Die Suche nach homologen Sequenzen in anderen Organismen fuhrte zu spektral verbesserten und starker rotverschobenen Channelrhodopsinen z B ChrimsonR 10 In Kombination mit ChR2 ermoglichen diese gelb rotlichtempfindlichen Channelrhodopsine die Kontrolle von zwei Populationen von Neuronen unabhangig voneinander mit Lichtpulsen unterschiedlicher Farben Ein blauverschobenes Channelrhodopsin wurde in der Alge Scherffelia dubia entdeckt Nach einigen Mutationen zur Verbesserung des Membranhandels und der Geschwindigkeit fuhrte das resultierende Werkzeug CheRiff zu grossen Photostromen bei Anregung durch blaues Licht 460 nm Ionenselektivitat Bearbeiten Die L132C Mutation CatCh erhoht die Permeabilitat fur Calciumionen und erzeugt sehr grosse Strome 11 wobei die vierfache Punktmutante CapChR1 die Kalziumleitfahigkeit weiter erhoht 12 Die Mutation von E90 zur positiv geladenen Aminosaure Arginin verwandelt Channelrhodopsin von einem unspezifischen Kationenkanal in einen Chlorid leitenden Kanal ChloC 13 Die Selektivitat fur Cl wurde durch Ersetzen negativ geladener Reste in der Pore des Kanals weiter verbessert 14 Selektive Chlorid leitende Channelrhodopsine iChloC GtACR werden benutzt um die Aktivitat bestimmter Neurone in der Taufliege und in der Maus gezielt zu dampfen und so die Funktion dieser Neurone fur ein bestimmtes Verhalten zu untersuchen 15 Anwendungen in der Forschung Bearbeiten nbsp Schematische Darstellung eines ChR2 RFP Fusionsproteins RFP ist ein rot fluoreszierendes Protein das ahnlich wie GFP zur Markierung von Zellstrukturen eingesetzt werden kann Wahrend der N Terminus die sieben Transmembrandomanen einschliesst reicht das C terminale Ende des ChR2 Proteins in den Intrazellularraum hinein und kann ersetzt oder verandert werden ohne dass die Funktion des Proteins als Ionenkanal beeintrachtigt wird Channelrhodopsine konnen mit einer Reihe von Transfektionstechniken virale Transfektion Elektroporation Genkanone in erregbaren Zellen wie Neuronen exprimiert produziert werden Vitamin A die Vorstufe des lichtabsorbierenden Chromophors Retinal ist in Wirbeltier Zellen meist schon vorhanden so dass sich erregbare Zellen die ein Channelrhodopsin exprimieren durch Beleuchtung einfach depolarisieren lassen Aufgrund dieser Eigenschaften interessieren sich Biotechnik und Neurowissenschaften fur den Einsatz von Channelrhodopsinen beispielsweise fur Anwendungen wie die Photostimulation von Neuronen Das blauempfindliche ChR2 in Kombination mit der durch Gelblicht aktiviertierbaren Chloridpumpe Halorhodopsin erlauben das An und Abschalten der neuronalen Aktivitat innerhalb von Millisekunden 16 Das neu entstehende Fachgebiet das sich mit der Kontrolle von genetisch modifizierten Zellen mittels Licht beschaftigt wird als Optogenetik bezeichnet Wird ChR2 mit einem Fluoreszenzlabel markiert konnen durch Licht angeregte Axone und Synapsen im intakten Gehirngewebe identifiziert werden 17 Diese Technik lasst sich zur Aufklarung der molekularen Ereignisse wahrend der Induktion synaptischer Plastizitat einsetzen 18 Mit Hilfe von ChR2 wurden weit reichende neuronale Bahnen im Gehirn kartiert 19 Dass sich das Verhalten transgener Tiere die ChR2 in einem Anteil ihrer Neuronen exprimieren durch intensive Beleuchtung mit Blaulicht beruhrungslos kontrollieren lasst wurde bereits fur Nematoden Taufliegen Zebrafische und Mause gezeigt 20 21 Die Sehfunktion blinder Mause konnte durch Expression von ChR2 in Bipolarzellen der Netzhaut im Auge teilweise wiederhergestellt werden 22 Vorstellbar ist auch eine zukunftige medizinische Verwendung von ChR2 bei bestimmten Formen der retinalen Degeneration oder zur Stimulation tief liegender Gehirnabschnitte Inzwischen wurden im Rahmen der pflanzlichen Optogenetikforschung sowohl ChR2 als auch ACR erfolgreich in Modellpflanzen etabliert 23 24 25 Dies bietet vollig neue Moglichkeiten pflanzliche Signaltransduktionsprozesse zu untersuchen Durch die Etablierung von ChR2 in Arabidopsis thailana wurde es z B moglich neue Erkenntnisse im Bereich der Erzeugung elektrischer Signale in Pflanzen zu erzielen 23 Einzelnachweise Bearbeiten Georg Nagel Doris Ollig Markus Fuhrmann Suneel Kateriya Anna Maria Musti Channelrhodopsin 1 A Light Gated Proton Channel in Green Algae In Science Band 296 Nr 5577 28 Juni 2002 ISSN 0036 8075 S 2395 2398 doi 10 1126 science 1072068 PMID 12089443 sciencemag org abgerufen am 28 Dezember 2017 Zhang F Prigge M Beyriere F et al Red shifted optogenetic excitation a tool for fast neural control derived from Volvox carteri In Nat Neurosci 11 Jahrgang Nr 6 23 April 2008 S 631 3 doi 10 1038 nn 2120 PMID 18432196 Elena G Govorunova Oleg A Sineshchekov Roger Janz Xiaoqin Liu John L Spudich Natural light gated anion channels A family of microbial rhodopsins for advanced optogenetics In Science Band 349 Nr 6248 7 August 2015 ISSN 0036 8075 S 647 650 doi 10 1126 science aaa7484 PMID 26113638 sciencemag org abgerufen am 28 Dezember 2017 Nagel G Szellas T 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Enrico Peter M Marcel Heim Linda Tillert Johannes Vierock Johannes Oppermann Jakob Walther Dietmar Schmitz David Owald Andrew J R Plested Benjamin R Rost Peter Hegemann Calcium permeable channelrhodopsins for the photocontrol of calcium signalling In Nature Communications Band 13 Nr 1 21 Dezember 2022 ISSN 2041 1723 S 7844 doi 10 1038 s41467 022 35373 4 nature com abgerufen am 3 Marz 2023 Jonas Wietek J Simon Wiegert Nona Adeishvili Franziska Schneider Hiroshi Watanabe Conversion of Channelrhodopsin into a Light Gated Chloride Channel In Science Band 344 Nr 6182 25 April 2014 ISSN 0036 8075 S 409 412 doi 10 1126 science 1249375 PMID 24674867 sciencemag org abgerufen am 16 Januar 2017 Jonas Wietek Riccardo Beltramo Massimo Scanziani Peter Hegemann Thomas G Oertner An improved chloride conducting channelrhodopsin for light induced inhibition of neuronal activity in vivo In Scientific Reports Band 5 7 Oktober 2015 ISSN 2045 2322 doi 10 1038 srep14807 PMID 26443033 PMC 4595828 freier 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