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Bei iTRAQ isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation handelt es sich um eine experimentelle Methode aus dem Bereich der Proteinanalytik und Proteomik Sie dient dazu verschiedene Proteine und Peptide per Massenspektrometrie gemeinsam zu quantifizieren 1 2 3 iTRAQ verwendet unter anderem die Isobarenmarkierung und die Tandem Massenspektrometrie Inhaltsverzeichnis 1 Verfahren 2 Datenauswertung 2 1 Peptid Ebene 2 2 Protein Ebene 2 3 Software 3 Anmerkungen 4 EinzelnachweiseVerfahren Bearbeiten nbsp iTRAQ Kit fur 8 ProbeniTRAQ wird in der Proteomik zur Proteincharakterisierung verwendet da mit der Methode bis zu vier mit der Weiterentwicklung 8 Plex bis zu acht Proben gleichzeitig untersucht werden konnen 4 Zur Anwendung des iTRAQ Verfahrens ist es zunachst notwendig den N Terminus und die Amino Seitenketten der in den Proben vorhandenen Peptide mit kovalent gebundenen mit verschiedenen Molekulen genannt Label bzw Tag verschiedener Molmassen zu markieren Dazu kommen derzeit zwei verschiedene Reagenzien zum Einsatz 4 plex und 8 plex Die Tags besitzen unterschiedliche Massen fragmentieren im Massenspektrometer verschieden und konnen daher im Massenspektrum unterschieden werden Es konnen beliebige Peptide verschiedenster Herkunft markiert werden Die gemeinsam zu untersuchenden Proben werden anschliessend vereint gepoolt dann ublicherweise per nano HPLC fraktioniert und mittels Tandem Massenspektrometrie MS MS analysiert Eine nachfolgende Datenbanksuche mit den erhaltenen Fragmentierungsdaten erlaubt es die Peptide zu identifizieren und so die entsprechenden Proteine zu bestimmen Die Fragmentierung der eingefuhrten Tags erzeugt dabei im unteren Massenbereich in Abhangigkeit vom verwendeten Tag Typ jeweils ein Ion mit einer typischen Masse das sogenannte Reporter Ion dessen Haufigkeit des Auftretens dazu verwendet werden kann die Menge der im gleichen Spektrum vorhandenen Peptide und damit die Proteine relativ zueinander zu bestimmen Es handelt sich also um eine gel freie Methode zur relativen Quantifizierung vergleichsweise Mengenbestimmung Ist die absolute Menge einer der Proben bekannt erlaubt das Verfahren auch eine absolute Quantifizierung da sich die Menge jeder weiteren Probe uber das Verhaltnis berechnen lasst Datenauswertung BearbeitenPeptid Ebene Bearbeiten nbsp Beispiel fur iTRAQ Reporter im Massenspektrum Reporter links rot eingekreist Die einfach geladenen Reporter Ionen werden im unteren Spektrum sichtbar bei den Masse Ladungs Verhaltnissen m z 114 115 116 und 117 Die Signale der Reporter Ionen in jedem MS MS Spektrum erlauben es die relative Haufigkeit Ratio der Peptide zum Reporter zu berechnen die uber dieses Spektrum identifiziert wurden Aufgrund von Messungenauigkeiten kann es durchaus auftreten dass die Reporter Ionen durch jeweils mehr als ein Signal im Spektrum vertreten sind und diese auf geeignete Weise und ohne Informationsverfalschung zu einem Peak zusammengefasst werden mussen Um beispielsweise die Intensitat mehrerer Peaks zusammenzufassen gibt es zwei mogliche Vorgehensweisen Summieren der Intensitaten der Peaks IntegrationHier die Flache des Spektrums zu integrieren fuhrt zu grosseren Fehlern falls die Abstande der Peaks und die Anzahl der Peaks nicht gleich sind 5 Die Intensitaten dieser Signale sollten also addiert werden um in diesem Fall einen kleineren Fehler zu erhalten Protein Ebene Bearbeiten Die Ratios der Peptide sind log normalverteilt 5 Daher reprasentiert der Median der Peptid Ratios eines Proteins die relative Quantifizierung dieses Proteins im Vergleich zum Reporter mit bekannter Menge 5 Software Bearbeiten Die Daten der MS MS Spektren konnen mit folgender frei verfugbarer Software analysiert werden i Tracker ein einfaches Programm das um die Peaks eine Trapezflache konstanter Breite berechnet und diese zur Bestimmung der Ratios verwendet 6 Quant A 1 ein Matlab Skript das den statistisch prazisen Algorithmus implementiert 5 Quant for windows A 2 die Windows Implementierung von Quant 7 jTraqX A 3 die portable Java Implementierung von Quant 8 Anmerkungen Bearbeiten Download auf sourceforge net Download auf sourceforge net Download auf sourceforge netEinzelnachweise Bearbeiten PL Ross YN Huang JN Marchese B Williamson K Parker S Hattan N Khainovski S Pillai S Dey S Daniels S Purkayastha P Juhasz S Martin M Bartlet Jones F He A Jacobson DJ Pappin Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine reactive isobaric tagging reagents In Mol Cell Proteomics 3 Jahrgang Nr 12 2004 S 1154 1169 doi 10 1074 mcp M400129 MCP200 PMID 15385600 LR Zieske A perspective on the use of iTRAQ reagent technology for protein complex and profiling studies In J Exp Bot 57 Jahrgang Nr 7 2006 S 1501 1508 doi 10 1093 jxb erj168 PMID 16574745 PR Gafken PD Lampe Methodologies for characterizing phosphoproteins by mass spectrometry In Cell Commun Adhes 13 Jahrgang Nr 5 6 2006 S 249 262 doi 10 1080 15419060601077917 PMID 17162667 PMC 2185548 freier Volltext L Choe M D Ascenzo NR Relkin D Pappin P Ross B Williamson S Guertin P Pribil KH Lee 8 plex quantitation of changes in cerebrospinal fluid protein expression in subjects undergoing intravenous immunoglobulin treatment for Alzheimer s disease In Proteomics 7 Jahrgang Nr 20 2007 S 3651 3560 doi 10 1002 pmic 200700316 PMID 17880003 a b c d A M Boehm S Puetz D Altenhofer A Sickmann M Falk Precise protein quantification based on peptide quantification using iTRAQ In BMC Bioinformatics 2007 8 S 214 doi 10 1186 1471 2105 8 214 IP Shadforth PJ Dunnley KS Lilley C Bessant i Tracker For quantitative proteomics using iTRAQ In BMC Genomics 6 Jahrgang 2005 S 145 doi 10 1186 1471 2164 6 145 PMID 16242023 PMC 1276793 freier Volltext A M Boehm D Altenhofer S Putz Precise and Statistically Sound Protein Quantification in Mass Spectrometry Based Proteomics Using iTRAQ In J Kung K Schneider R Wagner 2nd International Conference on Bioinformatics Research and Development BIRD 08 Schriftenreihe Informatik 26 Trauner Verlag Linz 2008 S 3 12 T Muth D Keller S M Puetz L Martens A Sickmann A M Boehm jTraqX a Free Platform Independent Tool for Isobaric Tag Quantitation at the Protein Level In Proteomics 2010 10 6 S 1223 1225 doi 10 1002 pmic 200900374 Abgerufen von https de wikipedia org w index php title ITRAQ amp oldid 218235547