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Kolonie Polymerasekettenreaktion Die englisch colony PCR umgangssprachlich Kolonie PCR ist eine molekularbiologische und

Kolonie-Polymerasekettenreaktion

Die Kolonie-Polymerasekettenreaktion (englisch colony PCR, umgangssprachlich ‚Kolonie-PCR‘) ist eine molekularbiologische und biochemische Methode zum Nachweis von bestimmten DNA-Sequenzen in Kolonien von Bakterien oder Pilzen durch eine Variante einer Polymerasekettenreaktion.

Prinzip Bearbeiten

Die Kolonie-Polymerasekettenreaktion verwendet als DNA-Vorlage keine gereinigte Plasmid-DNA oder chromosomale DNA, sondern aus dem Kulturmedium entnommene Bakterienkolonien. Bei Plasmiden mit hoher Kopieanzahl reichen bereits wenige Zellen aus, sie müssen jedoch im PCR-Ansatz in Suspension gebracht werden. Aufgrund der Bindung von Magnesiumionen aus dem PCR-Puffer durch die Bakterien und aufgrund der Erhöhung der Syntheserate der thermostabilen DNA-Polymerase (siehe PCR-Optimierung) wird die Magnesiumkonzentration im Vergleich zur PCR auf 5 millimolar erhöht und gelegentlich das Chaotrop Dimethylsulfoxid hinzugegeben. Die Lyse der Zellen und die Freisetzung der DNA aus dem Cytoplasma erfolgt entweder durch eine vorhergehende Lyse durch kurzes Erhitzen auf 95 °C und eine Reinigung oder durch Zusätze im Puffer, wie beispielsweise EDTA oder SDS in Verbindung mit dem Erhitzungsschritt zu Beginn der PCR oder ohne Vorbehandlung mit einer Lyse im ersten Denaturierungsschritt der PCR. Bei Hefen wurde eine Kolonie-Polymerasekettenreaktion mit einem Lyse-PCR-Puffer mit Lytikase, Octoxinolen, Polysorbaten und Gelatine beschrieben. Eine Variante der Kolonie-Polymerasekettenreaktion mit einer reversen Transkription wird zur Einzelzellanalyse von Säugerzellen verwendet. Nach der PCR erfolgt meistens eine Analyse der vervielfältigten DNA per Agarose-Gelelektrophorese, gelegentlich auch eine DNA-Sequenzierung.

Da Bestandteile des Kulturmediums (sowohl Flüssig- als auch Festmedien) die Reaktion hemmen können, wird deren Menge so gering wie möglich gehalten. Bei der Kolonie-Polymerasekettenreaktion wird meistens parallel eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle verwendet. Die Positivkontrolle enthält die gleiche DNA (gelegentlich mit einer anderen Länge des Transgens) sowie die gleichen Primer und zeigt die prinzipielle Funktionsfähigkeit der Reaktion an. Dagegen zeigt die Negativkontrolle (meistens ohne Zugabe von DNA) Kontaminationen an. Da keine gereinigte DNA verwendet wird, kann die Anwesenheit von genomischer DNA und zellulärer Proteine zu Fehlbindungen des Primers und somit vermehrt zu falsch positiven Produkten der PCR führen. Die falsch positiven Produkte weisen jedoch meistens eine andere Länge als das gewünschte Produkt auf und lassen sich dann in einer Agarose-Gelelektrophorese unterscheiden.

Anwendungen Bearbeiten

Die Kolonie-PCR ist eine schnelle Variante der Polymerasekettenreaktion, da direkt Kolonien der Mikroorganismen eingesetzt werden. Sie wird zur Überprüfung der gelungenen Transformation von DNA in die Zellen der Bakterien eingesetzt. Ebenso wird sie zur Identifikation rekombinanter Plasmide verwendet. Ein weiteres Einsatzgebiet ist die Taxonomie, um durch phylogenetische Untersuchungen die Verwandtschaftsverhältnisse der Arten oder Gattungen zu erforschen. Auch im Rahmen der Diagnostik von Krankheitserregern in der Human- und Veterinärmedizin wird die Kolonie-Polymerasekettenreaktion verwendet.

Literatur Bearbeiten

  • Cornel Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics. Sechste Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2008, ISBN 3-8274-2036-9.
  • Bing-Yuan Chen, Harry W. Janes: PCR Cloning Protocols. In: Methods in Molecular Biology, Band 192, Springer 2002, ISBN 9781592591770, S. 130.
  • A. R. Pavlov, N. V. Pavlova, S. A. Kozyavkin, A. I. Slesarev: Thermostable DNA Polymerases for a Wide Spectrum of Applications: Comparison of a Robust Hybrid TopoTaq to other enzymes. In: J. Kieleczawa: DNA Sequencing II: Optimizing Preparation and Cleanup. Jones und Bartlett 2006, ISBN 0-7637-3383-0, S. 241–257.

Weblinks Bearbeiten

  • Cornel Mülhardt: Kolonie-PCR. In: Laborjournal online. Abgerufen am 6. Januar 2014.

Einzelnachweise Bearbeiten

  1. M. A. Hofmann, D. A. Brian: Sequencing PCR DNA amplified directly from a bacterial colony. In: BioTechniques. Band 11, Nummer 1, Juli 1991, S. 30–31, ISSN 0736-6205. PMID 1954013.
  2. A. C. Ward: Rapid analysis of yeast transformants using colony-PCR. In: BioTechniques. Band 13, Nummer 3, September 1992, S. 350, ISSN 0736-6205. PMID 1389166.
  3. ↑ M. Bergkessel, C. Guthrie: Colony PCR. In: Methods in enzymology. Band 529, 2013, S. 299–309, ISSN 1557-7988. doi:10.1016/B978-0-12-418687-3.00025-2. PMID 24011056.
  4. ↑ H. Packeiser, C. Lim, B. Balagurunathan, J. Wu, H. Zhao: An extremely simple and effective colony PCR procedure for bacteria, yeasts, and microalgae. In: Applied biochemistry and biotechnology. Band 169, Nummer 2, Januar 2013, S. 695–700, ISSN 1559-0291. doi:10.1007/s12010-012-0043-8. PMID 23271627.
  5. ↑ Tapan Ganguly, Peiqin Chen, Rebecca Teetsel, Lan Ping Zhang, Elias Papaioannou, Joseph Cianciarulo: High-throughput sequencing of high copy number plasmids from bacterial cultures by heat lysis. In: Biotechniques (2005), Band 39, Nummer 3, S. 304–308. (Memento des Originals vom 22. Februar 2014 im Internet Archive)  Info: Der Archivlink wurde automatisch eingesetzt und noch nicht geprüft. Bitte prüfe Original- und Archivlink gemäß Anleitung und entferne dann diesen Hinweis.@1@2Vorlage:Webachiv/IABot/www.biotechniques.com.
  6. T. J. Kwiatkowski, H. Y. Zoghbi, S. A. Ledbetter, K. A. Ellison, A. C. Chinault: Rapid identification of yeast artificial chromosome clones by matrix pooling and crude lysate PCR. In: Nucleic acids research. Band 18, Nummer 23, Dezember 1990, S. 7191–7192, ISSN 0305-1048. PMID 2263507. PMC 332835 (freier Volltext).
  7. A. Ståhlberg, M. Kubista: The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. In: Expert review of molecular diagnostics. Band 14, Nummer 3, April 2014, S. 323–331, ISSN 1744-8352. doi:10.1586/14737159.2014.901154. PMID 24649819. PDF.
  8. V. Cattoir, O. Lemenand u. a.: The sodA gene as a target for phylogenetic dissection of the genus Haemophilus and accurate identification of human clinical isolates. In: International journal of medical microbiology : IJMM. Band 296, Nr. 8, Dezember 2006, S. 531–540, ISSN 1438-4221. doi:10.1016/j.ijmm.2006.06.005. PMID 17049306.
  9. J. R. Hayes, D. D. Wagner u. a.: Distribution of streptogramin resistance determinants among Enterococcus faecium from a poultry production environment of the USA. In: The Journal of antimicrobial chemotherapy. Band 55, Nr. 1, Januar 2005, S. 123–126, ISSN 0305-7453. doi:10.1093/jac/dkh491. PMID 15574480.
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Die Kolonie Polymerasekettenreaktion englisch colony PCR umgangssprachlich Kolonie PCR ist eine molekularbiologische und biochemische Methode zum Nachweis von bestimmten DNA Sequenzen in Kolonien von Bakterien oder Pilzen durch eine Variante einer Polymerasekettenreaktion 1 2 3 4 Inhaltsverzeichnis 1 Prinzip 2 Anwendungen 3 Literatur 4 Weblinks 5 EinzelnachweisePrinzip BearbeitenDie Kolonie Polymerasekettenreaktion verwendet als DNA Vorlage keine gereinigte Plasmid DNA oder chromosomale DNA sondern aus dem Kulturmedium entnommene Bakterienkolonien Bei Plasmiden mit hoher Kopieanzahl reichen bereits wenige Zellen aus sie mussen jedoch im PCR Ansatz in Suspension gebracht werden Aufgrund der Bindung von Magnesiumionen aus dem PCR Puffer durch die Bakterien und aufgrund der Erhohung der Syntheserate der thermostabilen DNA Polymerase siehe PCR Optimierung wird die Magnesiumkonzentration im Vergleich zur PCR auf 5 millimolar erhoht und gelegentlich das Chaotrop Dimethylsulfoxid hinzugegeben Die Lyse der Zellen und die Freisetzung der DNA aus dem Cytoplasma erfolgt entweder durch eine vorhergehende Lyse durch kurzes Erhitzen auf 95 C und eine Reinigung oder durch Zusatze im Puffer wie beispielsweise EDTA oder SDS in Verbindung mit dem Erhitzungsschritt zu Beginn der PCR oder ohne Vorbehandlung mit einer Lyse im ersten Denaturierungsschritt der PCR 5 4 Bei Hefen wurde eine Kolonie Polymerasekettenreaktion mit einem Lyse PCR Puffer mit Lytikase Octoxinolen Polysorbaten und Gelatine beschrieben 6 Eine Variante der Kolonie Polymerasekettenreaktion mit einer reversen Transkription wird zur Einzelzellanalyse von Saugerzellen verwendet 7 Nach der PCR erfolgt meistens eine Analyse der vervielfaltigten DNA per Agarose Gelelektrophorese gelegentlich auch eine DNA Sequenzierung 5 Da Bestandteile des Kulturmediums sowohl Flussig als auch Festmedien die Reaktion hemmen konnen wird deren Menge so gering wie moglich gehalten 5 Bei der Kolonie Polymerasekettenreaktion wird meistens parallel eine Positivkontrolle und eine Negativkontrolle verwendet Die Positivkontrolle enthalt die gleiche DNA gelegentlich mit einer anderen Lange des Transgens sowie die gleichen Primer und zeigt die prinzipielle Funktionsfahigkeit der Reaktion an Dagegen zeigt die Negativkontrolle meistens ohne Zugabe von DNA Kontaminationen an Da keine gereinigte DNA verwendet wird kann die Anwesenheit von genomischer DNA und zellularer Proteine zu Fehlbindungen des Primers und somit vermehrt zu falsch positiven Produkten der PCR fuhren Die falsch positiven Produkte weisen jedoch meistens eine andere Lange als das gewunschte Produkt auf und lassen sich dann in einer Agarose Gelelektrophorese unterscheiden Anwendungen BearbeitenDie Kolonie PCR ist eine schnelle Variante der Polymerasekettenreaktion da direkt Kolonien der Mikroorganismen eingesetzt werden Sie wird zur Uberprufung der gelungenen Transformation von DNA in die Zellen der Bakterien eingesetzt Ebenso wird sie zur Identifikation rekombinanter Plasmide verwendet 3 Ein weiteres Einsatzgebiet ist die Taxonomie um durch phylogenetische Untersuchungen die Verwandtschaftsverhaltnisse der Arten oder Gattungen zu erforschen 8 Auch im Rahmen der Diagnostik von Krankheitserregern in der Human und Veterinarmedizin wird die Kolonie Polymerasekettenreaktion verwendet 9 Literatur BearbeitenCornel Mulhardt Der Experimentator Molekularbiologie Genomics Sechste Auflage Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 2008 ISBN 3 8274 2036 9 Bing Yuan Chen Harry W Janes PCR Cloning Protocols In Methods in Molecular Biology Band 192 Springer 2002 ISBN 9781592591770 S 130 A R Pavlov N V Pavlova S A Kozyavkin A I Slesarev Thermostable DNA Polymerases for a Wide Spectrum of Applications Comparison of a Robust Hybrid TopoTaq to other enzymes In J Kieleczawa DNA Sequencing II Optimizing Preparation and Cleanup Jones und Bartlett 2006 ISBN 0 7637 3383 0 S 241 257 Weblinks BearbeitenCornel Mulhardt Kolonie PCR In Laborjournal online Abgerufen am 6 Januar 2014 Einzelnachweise Bearbeiten M A Hofmann D A Brian Sequencing PCR DNA amplified directly from a bacterial colony In BioTechniques Band 11 Nummer 1 Juli 1991 S 30 31 ISSN 0736 6205 PMID 1954013 A C Ward Rapid analysis of yeast transformants using colony PCR In BioTechniques Band 13 Nummer 3 September 1992 S 350 ISSN 0736 6205 PMID 1389166 a b M Bergkessel C Guthrie Colony PCR In Methods in enzymology Band 529 2013 S 299 309 ISSN 1557 7988 doi 10 1016 B978 0 12 418687 3 00025 2 PMID 24011056 a b H Packeiser C Lim B Balagurunathan J Wu H Zhao An extremely simple and effective colony PCR procedure for bacteria yeasts and microalgae In Applied biochemistry and biotechnology Band 169 Nummer 2 Januar 2013 S 695 700 ISSN 1559 0291 doi 10 1007 s12010 012 0043 8 PMID 23271627 a b c Tapan Ganguly Peiqin Chen Rebecca Teetsel Lan Ping Zhang Elias Papaioannou Joseph Cianciarulo High throughput sequencing of high copy number plasmids from bacterial cultures by heat lysis In Biotechniques 2005 Band 39 Nummer 3 S 304 308 PDF Memento des Originals vom 22 Februar 2014 im Internet Archive nbsp Info Der Archivlink wurde automatisch eingesetzt und noch nicht gepruft Bitte prufe Original und Archivlink gemass Anleitung und entferne dann diesen Hinweis 1 2 Vorlage Webachiv IABot www biotechniques com T J Kwiatkowski H Y Zoghbi S A Ledbetter K A Ellison A C Chinault Rapid identification of yeast artificial chromosome clones by matrix pooling and crude lysate PCR In Nucleic acids research Band 18 Nummer 23 Dezember 1990 S 7191 7192 ISSN 0305 1048 PMID 2263507 PMC 332835 freier Volltext A Stahlberg M Kubista The workflow of single cell expression profiling using quantitative real time PCR In Expert review of molecular diagnostics Band 14 Nummer 3 April 2014 S 323 331 ISSN 1744 8352 doi 10 1586 14737159 2014 901154 PMID 24649819 PDF V Cattoir O Lemenand u a The sodA gene as a target for phylogenetic dissection of the genus Haemophilus and accurate identification of 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