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CRISPR Cas12b Methode Die ist eine biochemische Methode um DNA zu schneiden Sie ist eine Variante der CRISPR Cas Methode

CRISPR/Cas12b-Methode

Die CRISPR/Cas12b-Methode ist eine biochemische Methode um DNA zu schneiden. Sie ist eine Variante der CRISPR/Cas-Methode unter Verwendung der Endonuklease Cas12b.

Prinzip Bearbeiten

Cas12b (alter Name C2c1, ein Cas des Typs V, Klasse II) bindet wie andere Cas-Proteine (Cas9, Cpf1) eine RNA mit einer crRNA repeat-Sequenz und einer crRNA spacer-Sequenz und schneidet in der unmittelbaren Umgebung doppelsträngige DNA unter Erzeugung eines sticky end-Doppelstrangbruchs. Weitere notwendige Faktoren sind das Vorhandensein einer tracrRNA und ein Protospacer Adjacent Motif (PAM) in der zu schneidenden Ziel-DNA. Die auf die von Cas12b gebundene crRNA repeat-Sequenz folgende crRNA spacer-Sequenz bindet an die Ziel-DNA.

Typen Bearbeiten

Cas12b aus Alicyclobacillus acidoterrestris, abgekürzt AacCas12b, besteht aus 1129 Aminosäuren und bindet an eine PAM der Sequenz TTN in der Ziel-DNA. Der Schnitt der Ziel-DNA erzeugt einen sticky end mit einem 5′-Überhang von 6–8 Nukleotiden 14–17 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem non-target-Strang bzw. 23–24 Nukleotide strangabwärts vom PAM auf dem target-Strang. Cas12b schneidet DNA bei einer Temperatur zwischen 37 und 60 °C, das Temperatur-Optimum liegt bei 48 °C. Bei 37 °C ist die Enzymaktivität vergleichsweise gering. Im Vergleich zu Cas9 oder Cpf1 (synonym Cas12a) erzeugt Cas12b weniger unspezifische Schnitte.

Cas12b aus Bacillus hisashii, abgekürzt BhCas12b, ist mit 1108 Aminosäuren kleiner als SpCas9 (1368 Aminosäuren) und hat daher auch ein kleineres Gen, was die Verwendung in viralen Vektoren (insbesondere AAV-Vektoren) erleichtert. Eine Verkürzung einer sgRNA um fünf Nukleotide am 5′-Ende verdreißigfacht die Enzymaktivität. Allerdings erzeugt der Wildtyp von BhCas12b bei 37 °C nur Einzelstrangbrüche. Daher wurde eine Mutante von BhCas12b namens BhCas12b v4 entwickelt (K846R/S893R/E837G), die auch bei der Körpertemperatur von Säugetieren Doppelstrangbrüche und weniger unspezifische Schnitte erzeugt.

Einzelnachweise Bearbeiten

  1. ↑ cas12b - CRISPR-associated endonuclease Cas12b - Alicyclobacillus acidoterrestris (strain ATCC 49025 / DSM 3922 / CIP 106132 / NCIMB 13137 / GD3B) - cas12b gene. In: uniprot.org. 16. Oktober 2013, abgerufen am 24. Januar 2019 (englisch).
  2. S. Shmakov, O. O. Abudayyeh, K. S. Makarova, Y. I. Wolf, J. S. Gootenberg, E. Semenova, L. Minakhin, J. Joung, S. Konermann, K. Severinov, F. Zhang, E. V. Koonin: Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems. In: Molecular cell. Band 60, Nummer 3, November 2015, S. 385–397, doi:10.1016/j.molcel.2015.10.008, PMID 26593719, PMC 4660269 (freier Volltext).
  3. ↑ Jonathan Strecker, Sara Jones, Balwina Koopal, Jonathan Schmid-Burgk, Bernd Zetsche, Linyi Gao, Kira S. Makarova, Eugene V. Koonin & Feng Zhang: Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing. In: Nature Communications. Band 10, Nummer 1, Januar 2019, S. 212, doi:10.1038/s41467-018-08224-4, PMID 30670702.
  4. L. Liu, P. Chen, M. Wang, X. Li, J. Wang, M. Yin, Y. Wang: C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism. In: Molecular cell. Band 65, Nummer 2, Januar 2017, S. 310–322, doi:10.1016/j.molcel.2016.11.040, PMID 27989439.
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Veröffentlichungsdatum:
Die CRISPR Cas12b Methode ist eine biochemische Methode um DNA zu schneiden Sie ist eine Variante der CRISPR Cas Methode unter Verwendung der Endonuklease Cas12b Prinzip BearbeitenCas12b alter Name C2c1 ein Cas des Typs V Klasse II bindet wie andere Cas Proteine Cas9 Cpf1 eine RNA mit einer crRNA repeat Sequenz und einer crRNA spacer Sequenz und schneidet in der unmittelbaren Umgebung doppelstrangige DNA unter Erzeugung eines sticky end Doppelstrangbruchs Weitere notwendige Faktoren sind das Vorhandensein einer tracrRNA und ein Protospacer Adjacent Motif PAM in der zu schneidenden Ziel DNA Die auf die von Cas12b gebundene crRNA repeat Sequenz folgende crRNA spacer Sequenz bindet an die Ziel DNA Typen BearbeitenCas12b aus Alicyclobacillus acidoterrestris abgekurzt AacCas12b besteht aus 1129 Aminosauren und bindet an eine PAM der Sequenz TTN in der Ziel DNA 1 Der Schnitt der Ziel DNA erzeugt einen sticky end mit einem 5 Uberhang von 6 8 Nukleotiden 14 17 Nukleotide strangabwarts vom PAM auf dem non target Strang bzw 23 24 Nukleotide strangabwarts vom PAM auf dem target Strang 1 Cas12b schneidet DNA bei einer Temperatur zwischen 37 und 60 C 1 das Temperatur Optimum liegt bei 48 C 2 Bei 37 C ist die Enzymaktivitat vergleichsweise gering 3 Im Vergleich zu Cas9 oder Cpf1 synonym Cas12a erzeugt Cas12b weniger unspezifische Schnitte 4 Cas12b aus Bacillus hisashii abgekurzt BhCas12b ist mit 1108 Aminosauren kleiner als SpCas9 1368 Aminosauren und hat daher auch ein kleineres Gen was die Verwendung in viralen Vektoren insbesondere AAV Vektoren erleichtert 3 Eine Verkurzung einer sgRNA um funf Nukleotide am 5 Ende verdreissigfacht die Enzymaktivitat 3 Allerdings erzeugt der Wildtyp von BhCas12b bei 37 C nur Einzelstrangbruche 3 Daher wurde eine Mutante von BhCas12b namens BhCas12b v4 entwickelt K846R S893R E837G die auch bei der Korpertemperatur von Saugetieren Doppelstrangbruche und weniger unspezifische Schnitte erzeugt 3 Einzelnachweise Bearbeiten a b c cas12b CRISPR associated endonuclease Cas12b Alicyclobacillus acidoterrestris strain ATCC 49025 DSM 3922 CIP 106132 NCIMB 13137 GD3B cas12b gene In uniprot org 16 Oktober 2013 abgerufen am 24 Januar 2019 englisch S Shmakov O O Abudayyeh K S Makarova Y I Wolf J S Gootenberg E Semenova L Minakhin J Joung S Konermann K Severinov F Zhang E V Koonin Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems In Molecular cell Band 60 Nummer 3 November 2015 S 385 397 doi 10 1016 j molcel 2015 10 008 PMID 26593719 PMC 4660269 freier Volltext a b c d e Jonathan Strecker Sara Jones Balwina Koopal Jonathan Schmid Burgk Bernd Zetsche Linyi Gao Kira S Makarova Eugene V Koonin amp Feng Zhang Engineering of CRISPR Cas12b for human genome editing In Nature Communications Band 10 Nummer 1 Januar 2019 S 212 doi 10 1038 s41467 018 08224 4 PMID 30670702 L Liu P Chen M Wang X Li J Wang M Yin Y Wang C2c1 sgRNA Complex Structure Reveals RNA Guided DNA Cleavage Mechanism In Molecular cell Band 65 Nummer 2 Januar 2017 S 310 322 doi 10 1016 j molcel 2016 11 040 PMID 27989439 Abgerufen von https de wikipedia org w index php title CRISPR Cas12b Methode amp oldid 232910735