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Flp FRT System Das ist eine Methode der Genetik zur Entfernung oder Einfügung von DNA Sequenzen Das wird unter anderem i

Flp/FRT-System

Das Flp/FRT-System ist eine Methode der Genetik zur Entfernung oder Einfügung von DNA-Sequenzen. Das Flp/FRT-System wird unter anderem in der reversen Genetik und im Kassettenaustauschverfahren zur Erzeugung transgener Organismen verwendet.

Eigenschaften Bearbeiten

Das Flp/FRT-System verwendet die Rekombinase Flippase (Flp), um DNA-Sequenzen ortsspezifisch auszutauschen. Die Rekombinase Flp bindet an FRT-Sequenzen und rekombiniert sie, z. B. in einem Chromosom oder einem Plasmid. Die minimale FRT-Sequenz lautet (34 Basenpaare):

Die Flippase bindet an beide Enden der FRT-Sequenz, die auf beiden DNA-Strängen zueinander palindromisch sind. In der Mitte der FRT-Sequenz liegt ein minimaler Abstandshalter von acht Basenpaaren (tctagaaa). Auf dem Plusstrang erfolgt durch die Flippase eine Hydrolyse der DNA vor dem Abstandshalter, auf dem Minusstrang nach dem Abstandshalter.

Obwohl verschiedene FRT-Sequenzen bekannt sind, funktioniert eine Rekombination nur zwischen zwei gleichen Sequenzen. Manche FRT-Sequenzen besitzen in 5'-Richtung eine zusätzliche DNA-Sequenz (5'-GAAGTTCCTATTCC-3') eine Base vor der FRT-Sequenz:

Dieses Segment ist nicht notwendig bei der Entfernung einer DNA-Sequenz (bei einer Deletion), jedoch notwendig für eine Insertion, z. B. beim RMCE-Kassettenaustauschverfahren. Die Insertion erfolgt unter Inversion der DNA-Sequenzen. Nach der Rekombination verbleiben Teile der FRT-Sequenzen (englisch FRT-Twins). Die Rekombination kann durch gewebsspezifische Promotoren auf einzelne Organe beschränkt werden. Durch induzierbare Promotoren (z. B. durch Tamoxifen oder Mifepriston) kann der Rekombinationszeitpunkt gesteuert werden, z. B. bei der Expression toxischer Proteine oder bei Letalfaktoren.

Anwendungen Bearbeiten

Das Flp/FRT-System wird zur Erzeugung von Mutanten mit Deletionen oder Insertionen verwendet, z. B. beim Gen-Knockout, bei der Mosaikenerzeugung oder bei der Erzeugung transgener embryonaler Stammzellen. Es wurde unter anderem in Mäusen, Drosophila spp., der Bäckerhefe und Pflanzen verwendet.

Eine Alternative zum Flp/FRT-System ist das Cre/loxP-System.

Einzelnachweise Bearbeiten

  1. Zhu XD, Sadowski PD: Cleavage-dependent Ligation by the FLP Recombinase. In: Journal of Biological Chemistry. 270. Jahrgang, Nr. 39, 1995, S. 23044–54, doi:10.1074/jbc.270.39.23044, PMID 7559444.
  2. Schlake T, Bode J: Use of mutated FLP recognition target (FRT) sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci. In: Biochemistry. 33. Jahrgang, Nr. 43, 1994, S. 12746–12751, doi:10.1021/bi00209a003, PMID 7947678.
  3. S. Turan, J. Kuehle, A. Schambach, C. Baum, J. Bode: Multiplexing RMCE: Versatile Extensions of the Flp-Recombinase-Mediated Cassette-Exchange Technology. In: J. Mol. Biol. 402. Jahrgang, Nr. 1, 2010, S. 52–69, doi:10.1016/j.jmb.2010.07.015, PMID 20650281.
  4. S., Bode, J. Turan: Site-specific recombinases: from tag-and-target- to tag-and-exchange-based genomic modifications. In: FASEB J. 25. Jahrgang, 2011, S. 4088–4107, doi:10.1096/fj.11-186940, PMID 21891781.
  5. S. Turan, C. Zehe, J. Kuehle, J. Qiao, J. Bode: Recombinase-mediated cassette exchange (RMCE) - a rapidly-expanding toolbox for targeted genomic modifications. In: Gene. Band 515, Nummer 1, Februar 2013, S. 1–27, ISSN 1879-0038. doi:10.1016/j.gene.2012.11.016. PMID 23201421.
  6. D. A. Hutcheson, G. Kardon: Genetic manipulations reveal dynamic cell and gene functions: Cre-ating a new view of myogenesis. In: Cell cycle (Georgetown, Tex.). Band 8, Nummer 22, November 2009, S. 3675–3678, ISSN 1551-4005. PMID 19844163. PMC 2880528 (freier Volltext).
  7. M. Mishina, K. Sakimura: Conditional gene targeting on the pure C57BL/6 genetic background. In: Neuroscience research. Band 58, Nummer 2, Juni 2007, S. 105–112, ISSN 0168-0102. doi:10.1016/j.neures.2007.01.004. PMID 17298852.
  8. T. Lee, L. Luo: Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. In: Trends in neurosciences. Band 24, Nummer 5, Mai 2001, S. 251–254, ISSN 0166-2236. PMID 11311363.
  9. R. Mortensen: Overview of gene targeting by homologous recombination. In: Current protocols in molecular biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. Chapter 23November 2006, S. Unit 23.1, ISSN 1934-3647. doi:10.1002/0471142727.mb2301s76. PMID 19444792.
  10. J. E. Belizário, P. Akamini, P. Wolf, B. Strauss, J. Xavier-Neto: New routes for transgenesis of the mouse. In: Journal of applied genetics. Band 53, Nummer 3, August 2012, S. 295–315, ISSN 2190-3883. doi:10.1007/s13353-012-0096-y. PMID 22569888.
  11. N. A. Theodosiou, T. Xu: Use of FLP/FRT system to study Drosophila development. In: Methods (San Diego, Calif.). Band 14, Nummer 4, April 1998, S. 355–365, ISSN 1046-2023. doi:10.1006/meth.1998.0591. PMID 9608507.
  12. H. P. Schweizer: Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics. In: Journal of molecular microbiology and biotechnology. Band 5, Nummer 2, 2003, S. 67–77, ISSN 1464-1801. PMID 12736528.
  13. H. Luo, A. P. Kausch: Application of FLP/FRT site-specific DNA recombination system in plants. In: Genetic engineering. Band 24, 2002, S. 1–16, ISSN 0196-3716. PMID 12416298.
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Das Flp FRT System ist eine Methode der Genetik zur Entfernung oder Einfugung von DNA Sequenzen Das Flp FRT System wird unter anderem in der reversen Genetik und im Kassettenaustauschverfahren zur Erzeugung transgener Organismen verwendet Eigenschaften BearbeitenDas Flp FRT System verwendet die Rekombinase Flippase Flp um DNA Sequenzen ortsspezifisch auszutauschen Die Rekombinase Flp bindet an FRT Sequenzen und rekombiniert sie z B in einem Chromosom oder einem Plasmid Die minimale FRT Sequenz lautet 34 Basenpaare 5 GAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC3 Die Flippase bindet an beide Enden der FRT Sequenz die auf beiden DNA Strangen zueinander palindromisch sind In der Mitte der FRT Sequenz liegt ein minimaler Abstandshalter von acht Basenpaaren tctagaaa Auf dem Plusstrang erfolgt durch die Flippase eine Hydrolyse der DNA vor dem Abstandshalter auf dem Minusstrang nach dem Abstandshalter 1 Obwohl verschiedene FRT Sequenzen bekannt sind funktioniert eine Rekombination nur zwischen zwei gleichen Sequenzen 2 3 Manche FRT Sequenzen besitzen in 5 Richtung eine zusatzliche DNA Sequenz 5 GAAGTTCCTATTCC 3 eine Base vor der FRT Sequenz 5 GAAGTTCCTATTCcGAAGTTCCTATTCtctagaaaGtATAGGAACTTC3 Dieses Segment ist nicht notwendig bei der Entfernung einer DNA Sequenz bei einer Deletion jedoch notwendig fur eine Insertion z B beim RMCE Kassettenaustauschverfahren 4 Die Insertion erfolgt unter Inversion der DNA Sequenzen Nach der Rekombination verbleiben Teile der FRT Sequenzen englisch FRT Twins 5 Die Rekombination kann durch gewebsspezifische Promotoren auf einzelne Organe beschrankt werden Durch induzierbare Promotoren z B durch Tamoxifen oder Mifepriston kann der Rekombinationszeitpunkt gesteuert werden z B bei der Expression toxischer Proteine oder bei Letalfaktoren 6 Anwendungen BearbeitenDas Flp FRT System wird zur Erzeugung von Mutanten mit Deletionen oder Insertionen verwendet z B beim Gen Knockout bei der Mosaikenerzeugung oder bei der Erzeugung transgener embryonaler Stammzellen 7 8 9 Es wurde unter anderem in Mausen 10 Drosophila spp 11 der Backerhefe 12 und Pflanzen verwendet 13 Eine Alternative zum Flp FRT System ist das Cre loxP System Einzelnachweise Bearbeiten Zhu XD Sadowski PD Cleavage dependent Ligation by the FLP Recombinase In Journal of Biological Chemistry 270 Jahrgang Nr 39 1995 S 23044 54 doi 10 1074 jbc 270 39 23044 PMID 7559444 Schlake T Bode J Use of mutated FLP recognition target FRT sites for the exchange of expression cassettes at defined chromosomal loci In Biochemistry 33 Jahrgang Nr 43 1994 S 12746 12751 doi 10 1021 bi00209a003 PMID 7947678 S Turan J Kuehle A Schambach C Baum J Bode Multiplexing RMCE Versatile Extensions of the Flp Recombinase Mediated Cassette Exchange Technology In J Mol Biol 402 Jahrgang Nr 1 2010 S 52 69 doi 10 1016 j jmb 2010 07 015 PMID 20650281 S Bode J Turan Site specific recombinases from tag and target to tag and exchange based genomic modifications In FASEB J 25 Jahrgang 2011 S 4088 4107 doi 10 1096 fj 11 186940 PMID 21891781 S Turan C Zehe J Kuehle J Qiao J Bode Recombinase mediated cassette exchange RMCE a rapidly expanding toolbox for targeted genomic modifications In Gene Band 515 Nummer 1 Februar 2013 S 1 27 ISSN 1879 0038 doi 10 1016 j gene 2012 11 016 PMID 23201421 D A Hutcheson G Kardon Genetic manipulations reveal dynamic cell and gene functions Cre ating a new view of myogenesis In Cell cycle Georgetown Tex Band 8 Nummer 22 November 2009 S 3675 3678 ISSN 1551 4005 PMID 19844163 PMC 2880528 freier Volltext M Mishina K Sakimura Conditional gene targeting on the pure C57BL 6 genetic background In Neuroscience research Band 58 Nummer 2 Juni 2007 S 105 112 ISSN 0168 0102 doi 10 1016 j neures 2007 01 004 PMID 17298852 T Lee L Luo Mosaic analysis with a repressible cell marker MARCM for Drosophila neural development In Trends in neurosciences Band 24 Nummer 5 Mai 2001 S 251 254 ISSN 0166 2236 PMID 11311363 R Mortensen Overview of gene targeting by homologous recombination In Current protocols in molecular biology edited by Frederick M Ausubel et al Chapter 23November 2006 S Unit 23 1 ISSN 1934 3647 doi 10 1002 0471142727 mb2301s76 PMID 19444792 J E Belizario P Akamini P Wolf B Strauss J Xavier Neto New routes for transgenesis of the mouse In Journal of applied genetics Band 53 Nummer 3 August 2012 S 295 315 ISSN 2190 3883 doi 10 1007 s13353 012 0096 y PMID 22569888 N A Theodosiou T Xu Use of FLP FRT system to study Drosophila development In Methods San Diego Calif Band 14 Nummer 4 April 1998 S 355 365 ISSN 1046 2023 doi 10 1006 meth 1998 0591 PMID 9608507 H P Schweizer Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp FRT system in bacterial genetics In Journal of molecular microbiology and biotechnology Band 5 Nummer 2 2003 S 67 77 ISSN 1464 1801 PMID 12736528 H Luo A P Kausch Application of FLP FRT site specific DNA recombination system in plants In Genetic engineering Band 24 2002 S 1 16 ISSN 0196 3716 PMID 12416298 Abgerufen von https de wikipedia 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