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Primer Extension Die ˊpʁaɪ mɐ ɪkˊstenʃn ist eine molekularbiologische Methode die im Allgemeinen zur Bestimmung der Base

Primer Extension

Die Primer Extension [ˊpʁaɪ̯mɐ][ɪkˊstenʃn] ist eine molekularbiologische Methode, die im Allgemeinen zur Bestimmung der Basensequenz des 5'-Endes der mRNA dient. Dazu werden aus einem Gemisch von RNA-Molekülen die 5'-Enden einer bestimmten RNA-Spezies ermittelt. Das 5'-Ende ist zumeist auch ein Transkriptionsstartpunkt des betrachteten Gens.

Beschreibung der Methode Bearbeiten

Bei der Primer Extension wird ein kurzes, (zumeist) synthetisch hergestelltes DNA-Oligonukleotid – der sogenannte Primer – an zuvor isolierte RNA angelagert. Dazu werden die RNA und der zuvor meistens mit T4-Polynukleotidkinase radioaktiv markierte Primer zusammengegeben und erhitzt. Durch das Erhitzen trennen sich doppelsträngige Bereiche der RNA. Nachfolgend wird der Ansatz wieder abgekühlt, wodurch sich der Primer an die komplementäre Basensequenz der RNA anlagern kann. Dadurch findet der Primer im RNA-Gemisch das entsprechende Gen.

Das System enthält im Wesentlichen noch zwei weitere Komponenten. Das sind die Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs, kurz dATP, dCTP, dGTP und dTTP), die als Nukleinbasen fungieren und ein Enzym, das als Reverse Transkriptase bezeichnet wird. Die Reverse Transkriptase bindet am DNA/RNA-Hybrid-Molekül und füllt den Primer am 3'-Ende mit Nukleotiden auf. Dabei dient die mRNA des betrachteten Gens als Matrize. Durch die Verlängerung (Extension) wird der Primer zur cDNA. Die cDNA kann nach Trennung von der RNA (z. B. durch alkalische Lyse und/oder RNA-abbauende Enzyme) einer weiterführenden Analyse unterzogen werden.

Im Allgemeinen läuft die weiterführende Analyse so, dass der cDNA aus dem Primer-Extension-Ansatz ein Sequenzierungs-Ansatz bereits bekannter genomischer DNA gegenübergestellt wird. Das bekannte, zumeist klonierte Stück DNA beinhaltet den Primer-Bereich und sollte an der "anderen" Seite über das noch nicht genau kartierte "vordere" Ende des betreffenden Gens hinausreichen. Die Sequenzier-Reaktionen werden mit dem gleichen Primer durchgeführt wie die cDNA-Synthese. Die Primer-Extension-Produkte und die Reaktionen der DNA-Sequenzierung werden auf ein sogenanntes „Sequenziergel“ aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen. Anhand des Vergleiches der DNA-Fragmentlängen kann der Transkriptionsstartpunkt ermittelt werden.

Entstehung Bearbeiten

Die Primer Extension wurde in den späten 1970ern entwickelt. Dabei wurden im Wesentlichen zwei Richtungen verfolgt und zusammengeführt: die DNA-Sequenzierung durch teilweisen Kettenabbruch und die cDNA-Synthese durch Reverse Transkriptasen. Während primer extension anfangs eher als Wortgruppe denn als Name einer Methode eingesetzt wurde, setzte sich der Begriff Anfang der 1980er als terminus technicus durch und bezeichnet zumeist die oben beschriebene Variante. Methoden, bei denen die Sequenzierung durch teilweisen Kettenabbruch direkt an die cDNA-Synthese gekoppelt sind, werden heute eher als direkte RNA-Sequenzierung bezeichnet.

Homonyme und Synonyme Bearbeiten

Homonyme: Neben einigen von Primer Extension verschiedenen molekulargenetischen Methoden, bei denen ebenfalls die Verlängerung eines Oligonukleotides durch Nukleinsäurepolymerasen eine Rolle spielt, wird die Wortgruppe "...primer extension..." vor allem bei der Beschreibung der DNA-Replikation eingesetzt.

Synonyme: cDNA extension by reverse transcriptase; reverse transcriptase mapping; RT-mapping; RT-Kartierung

Einzelnachweise Bearbeiten

  1. Sanger, F. & Coulson, A. R. (1975): A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. In: J. Mol. Biol. 94:441-444. PMID 1100841
  2. Sanger, F. et al. (1977): DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. In: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467. PMID 271968
  3. Thompson, J.A.et al. (1979): Characterization of the 5'-terminal structure of simian virus 40 early mRNA's. In: J. Virol. 31:437-446. PMID 90173
  4. Qu, H.L. et al. (1981): Improved methods for structure probing in large RNAs: a rapid 'heterologous' sequencing approach is coupled to the direct mapping of nuclease accessible sites. Application to the 5' terminal domain of eukaryotic 28S rRNA. In: Nucl. Acids. Res. 11:5903-5920. PMID 6193488

Literatur Bearbeiten

  • Walmsley, M. (2000): Primer Extension Analysis of mRNA. In: The Nucleic Acid Protocols Handbook. ISBN 978-0-89603-459-4
  • Ross, W. & Gourse, R.L. (2008): Analysis of RNA polymerase-promoter complex formation. In: Methods. 47(1):13-24. PMID 18952176 doi:10.1016/j.ymeth.2008.10.018
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Die Primer Extension ˊpʁaɪ mɐ ɪkˊstenʃn ist eine molekularbiologische Methode die im Allgemeinen zur Bestimmung der Basensequenz des 5 Endes der mRNA dient Dazu werden aus einem Gemisch von RNA Molekulen die 5 Enden einer bestimmten RNA Spezies ermittelt Das 5 Ende ist zumeist auch ein Transkriptionsstartpunkt des betrachteten Gens Inhaltsverzeichnis 1 Beschreibung der Methode 2 Entstehung 3 Homonyme und Synonyme 4 Einzelnachweise 5 LiteraturBeschreibung der Methode BearbeitenBei der Primer Extension wird ein kurzes zumeist synthetisch hergestelltes DNA Oligonukleotid der sogenannte Primer an zuvor isolierte RNA angelagert Dazu werden die RNA und der zuvor meistens mit T4 Polynukleotidkinase radioaktiv markierte Primer zusammengegeben und erhitzt Durch das Erhitzen trennen sich doppelstrangige Bereiche der RNA Nachfolgend wird der Ansatz wieder abgekuhlt wodurch sich der Primer an die komplementare Basensequenz der RNA anlagern kann Dadurch findet der Primer im RNA Gemisch das entsprechende Gen Das System enthalt im Wesentlichen noch zwei weitere Komponenten Das sind die Desoxyribonukleosidtriphosphate dNTPs kurz dATP dCTP dGTP und dTTP die als Nukleinbasen fungieren und ein Enzym das als Reverse Transkriptase bezeichnet wird Die Reverse Transkriptase bindet am DNA RNA Hybrid Molekul und fullt den Primer am 3 Ende mit Nukleotiden auf Dabei dient die mRNA des betrachteten Gens als Matrize Durch die Verlangerung Extension wird der Primer zur cDNA Die cDNA kann nach Trennung von der RNA z B durch alkalische Lyse und oder RNA abbauende Enzyme einer weiterfuhrenden Analyse unterzogen werden Im Allgemeinen lauft die weiterfuhrende Analyse so dass der cDNA aus dem Primer Extension Ansatz ein Sequenzierungs Ansatz bereits bekannter genomischer DNA gegenubergestellt wird Das bekannte zumeist klonierte Stuck DNA beinhaltet den Primer Bereich und sollte an der anderen Seite uber das noch nicht genau kartierte vordere Ende des betreffenden Gens hinausreichen Die Sequenzier Reaktionen werden mit dem gleichen Primer durchgefuhrt wie die cDNA Synthese Die Primer Extension Produkte und die Reaktionen der DNA Sequenzierung werden auf ein sogenanntes Sequenziergel aufgetragen und einer Elektrophorese unterzogen Anhand des Vergleiches der DNA Fragmentlangen kann der Transkriptionsstartpunkt ermittelt werden Entstehung BearbeitenDie Primer Extension wurde in den spaten 1970ern entwickelt Dabei wurden im Wesentlichen zwei Richtungen verfolgt und zusammengefuhrt die DNA Sequenzierung durch teilweisen Kettenabbruch 1 2 und die cDNA Synthese durch Reverse Transkriptasen 3 4 Wahrend primer extension anfangs eher als Wortgruppe denn als Name einer Methode eingesetzt wurde setzte sich der Begriff Anfang der 1980er als terminus technicus durch und bezeichnet zumeist die oben beschriebene Variante Methoden bei denen die Sequenzierung durch teilweisen Kettenabbruch direkt an die cDNA Synthese gekoppelt sind werden heute eher als direkte RNA Sequenzierung bezeichnet Homonyme und Synonyme BearbeitenHomonyme Neben einigen von Primer Extension verschiedenen molekulargenetischen Methoden bei denen ebenfalls die Verlangerung eines Oligonukleotides durch Nukleinsaurepolymerasen eine Rolle spielt wird die Wortgruppe primer extension vor allem bei der Beschreibung der DNA Replikation eingesetzt Synonyme cDNA extension by reverse transcriptase reverse transcriptase mapping RT mapping RT KartierungEinzelnachweise Bearbeiten Sanger F amp Coulson A R 1975 A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase In J Mol Biol 94 441 444 PMID 1100841 Sanger F et al 1977 DNA sequencing with chain terminating inhibitors In Proc Natl Acad Sci U S A 74 5463 5467 PMID 271968 Thompson J A et al 1979 Characterization of the 5 terminal structure of simian virus 40 early mRNA s In J Virol 31 437 446 PMID 90173 Qu H L et al 1981 Improved methods for structure probing in large RNAs a rapid heterologous sequencing approach is coupled to the direct mapping of nuclease accessible sites Application to the 5 terminal domain of eukaryotic 28S rRNA In Nucl Acids Res 11 5903 5920 PMID 6193488Literatur BearbeitenWalmsley M 2000 Primer Extension Analysis of mRNA In The Nucleic Acid Protocols Handbook ISBN 978 0 89603 459 4 Ross W amp Gourse R L 2008 Analysis of RNA polymerase promoter complex formation In Methods 47 1 13 24 PMID 18952176 doi 10 1016 j ymeth 2008 10 018 Abgerufen von https de wikipedia org w index php title Primer Extension amp oldid 226788594