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φ29 DNA Polymerase Die ist ein Enzym aus der Gruppe der DNA Polymerasen und wird vom Bakteriophagen φ29 gebildet nach PD

φ29-DNA-Polymerase

Die φ29-DNA-Polymerase ist ein Enzym aus der Gruppe der DNA-Polymerasen und wird vom Bakteriophagen φ29 gebildet.

φ29-DNA-Polymerase
nach PDB 1XHX
Andere Namen

Bacillus phage φ29 gene product 2

Vorhandene Strukturdaten: PDB 1XHZ, PDB 1XI1

Masse/Länge Primärstruktur 575 Aminosäuren, 66.714 Da
Bezeichner
Externe IDs
Enzymklassifikation
EC, Kategorie 2.7.7.7
Orthologe (Bacillus phage φ29)
Entrez 6446511
UniProt P03680


PubMed-Suche 6446511

Eigenschaften Bearbeiten

Als DNA-Polymerase des Typs B verlängert sie DNA-Sequenzen am 3′-Ende, wenn sie als DNA-Doppelstrang vorkommen und nach dem 3'-Ende mindestens ein Einzelstrang als Matrize vorliegt. Sie dient dem Phagen zur DNA-Replikation des viralen Genoms. Bei ringförmiger DNA wie Plasmiden erfolgt eine rolling circle replication. Bei der Replikation bildet die φ29-DNA-Polymerase ein Heterodimer mit dem Primer Terminal Protein (TP) und bindet an den Replikationsursprung an einem der beiden 5'-Enden der Phagen-DNA. Die Hydroxygruppe des Serins an der Position 232 dient als Primer. φ29-DNA-Polymerase besitzt drei Enzymaktivitäten: DNA-Replikation, Desoxynukleotidylierung des TP mit Desoxy-Adenosinmonophosphat über einen Phosphorsäureester-Übergangszustand und eine 3′→5′-Exonuklease des Typs II zur Fehlerkorrektur (proof-reading). Während die Exonuklease für eine geringe Fehlerrate während der Synthese sorgt, ist die Bindung des TP und der Beginn der Synthese vergleichsweise fehlerhaft. Sie beginnt bei der zweiten Thyminbase und gleitet dann ein paar Basen zurück. Die φ29-DNA-Polymerase ist strangversetzend, wodurch eine Synthese auch an einem Doppelstrang erfolgen kann. Das Leucin an der Position 384 ist an der Spezifität der Bindung von Desoxynukleotiden beteiligt. Tyrosine an den Positionen 226 und 390 sind an der Translokation entlang der Matrize beteiligt. Die Φ29-DNA-Polymerase besitzt eine höhere Affinität zu einzelsträngiger als zu doppelsträngiger DNA. Die Tyrosine an den Positionen 256 und 390 bewirken eine Erhöhung der Affinität der Nukleotidbindung. Das Tyrosin an der Position 59, das Histidin an der Position 61 und ein Phenylalanin an der Position 69 dienen der DNA-Bindung der Exonuklease. Die φ29-DNA-Polymerase ist keine thermostabile DNA-Polymerase.

Die Φ29-DNA-Polymerase katalysiert die Reaktion:

Desoxynukleosidtriphosphat + DNA(n) Diphosphat + DNA(n+1)

Anwendungen Bearbeiten

Die φ29-DNA-Polymerase wird in der Biochemie zur isothermen DNA-Amplifikation eingesetzt, z. B. beim Gibson Assembly. Eine thermostabile Alternative ist das bei 65 °C thermostabile große Fragment der Bst-DNA-Polymerase aus Bacillus stearothermophilus.

Die Φ29-DNA-Polymerase wird zur Kopie von Genomen eingesetzt (Genomamplifikation, engl. whole genome amplification, WGA), da sie eine hohe Prozessivität, eine geringe Fehlerrate (wegen proof reading), einen geringen bias besitzt und weil sie lange DNA-Fragmente über 10kb und eine höhere Produktkonzentration als thermostabile DNA-Polymerasen erzeugt. Als isothermale Methode wird zudem kein Thermocycler benötigt, als Primer werden bei der WGA oftmals zufällige Nukleotid-Hexamere verwendet.

Literatur Bearbeiten

Weblinks Bearbeiten

  • MeSH Φ29-DNA-Polymerase

Einzelnachweise Bearbeiten

  1. F. B. Dean, J. R. Nelson, T. L. Giesler, R. S. Lasken: Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply-primed rolling circle amplification. In: Genome Research. Band 11, Nummer 6, Juni 2001, S. 1095–1099, doi:10.1101/gr.180501, PMID 11381035, PMC 311129 (freier Volltext).
  2. V. Truniger, J. M. Lázaro, M. de Vega, L. Blanco, M. Salas: phi 29 DNA polymerase residue Leu384, highly conserved in motif B of eukaryotic type DNA replicases, is involved in nucleotide insertion fidelity. In: The Journal of Biological Chemistry. Band 278, Nummer 35, August 2003, S. 33482–33491, doi:10.1074/jbc.M303052200, PMID 12805385.
  3. J. M. Dahl, H. Wang, J. M. Lázaro, M. Salas, K. R. Lieberman: Dynamics of translocation and substrate binding in individual complexes formed with active site mutants of {phi}29 DNA polymerase. In: The Journal of Biological Chemistry. Band 289, Nummer 10, März 2014, S. 6350–6361, doi:10.1074/jbc.M113.535666, PMID 24464581, PMC 3945302 (freier Volltext).
  4. J. Saturno, L. Blanco, M. Salas, J. A. Esteban: A novel kinetic analysis to calculate nucleotide affinity of proofreading DNA polymerases. Application to phi 29 DNA polymerase fidelity mutants. In: The Journal of Biological Chemistry. Band 270, Nummer 52, Dezember 1995, S. 31235–31243, PMID 8537389.
  5. M. de Vega, J. M. Lázaro, M. Salas: Phage phi 29 DNA polymerase residues involved in the proper stabilisation of the primer-terminus at the 3'-5' exonuclease active site. In: Journal of Molecular Biology. Band 304, Nummer 1, November 2000, S. 1–9, doi:10.1006/jmbi.2000.4178, PMID 11071805.
  6. Alsmadi O, Alkayal F, Monies D, Meyer BF: Specific and complete human genome amplification with improved yield achieved by phi29 DNA polymerase and a novel primer at elevated temperature. In: BMC Res Notes. 2. Jahrgang, 2009, S. 48, doi:10.1186/1756-0500-2-48, PMID 19309528, PMC 2663774 (freier Volltext).
  7. L. Blanco, A. Bernad, J. M. Lázaro, G. Martín, C. Garmendia, M. Salas: Highly efficient DNA synthesis by the phage phi 29 DNA polymerase. Symmetrical mode of DNA replication. In: The Journal of biological chemistry. Band 264, Nummer 15, Mai 1989, S. 8935–8940, PMID 2498321.
  8. T. J. Pugh, A. D. Delaney, N. Farnoud et al.: Impact of whole genome amplification on analysis of copy number variants. In: Nucleic Acids Res. 36. Jahrgang, Nr. 13, August 2008, S. e80, doi:10.1093/nar/gkn378, PMID 18559357, PMC 2490749 (freier Volltext).
  9. ↑ R. Pinard, A. de Winter, G. J. Sarkis et al.: Assessment of whole genome amplification-induced bias through high-throughput, massively parallel whole genome sequencing. In: BMC Genomics. 7. Jahrgang, 2006, S. 216, doi:10.1186/1471-2164-7-216, PMID 16928277, PMC 1560136 (freier Volltext).
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Veröffentlichungsdatum:
Die f29 DNA Polymerase ist ein Enzym aus der Gruppe der DNA Polymerasen und wird vom Bakteriophagen f29 gebildet f29 DNA Polymerasenach PDB 1XHXAndere Namen Bacillus phage f29 gene product 2Vorhandene Strukturdaten PDB 1XHZ PDB 1XI1Masse Lange Primarstruktur 575 Aminosauren 66 714 DaBezeichnerExterne IDs UniProt P03680EnzymklassifikationEC Kategorie 2 7 7 7Orthologe Bacillus phage f29 Entrez 6446511UniProt P03680PubMed Suche 6446511 Inhaltsverzeichnis 1 Eigenschaften 2 Anwendungen 3 Literatur 4 Weblinks 5 EinzelnachweiseEigenschaften BearbeitenAls DNA Polymerase des Typs B verlangert sie DNA Sequenzen am 3 Ende wenn sie als DNA Doppelstrang vorkommen und nach dem 3 Ende mindestens ein Einzelstrang als Matrize vorliegt Sie dient dem Phagen zur DNA Replikation des viralen Genoms Bei ringformiger DNA wie Plasmiden erfolgt eine rolling circle replication 1 Bei der Replikation bildet die f29 DNA Polymerase ein Heterodimer mit dem Primer Terminal Protein TP und bindet an den Replikationsursprung an einem der beiden 5 Enden der Phagen DNA Die Hydroxygruppe des Serins an der Position 232 dient als Primer f29 DNA Polymerase besitzt drei Enzymaktivitaten DNA Replikation Desoxynukleotidylierung des TP mit Desoxy Adenosinmonophosphat uber einen Phosphorsaureester Ubergangszustand und eine 3 5 Exonuklease des Typs II zur Fehlerkorrektur proof reading Wahrend die Exonuklease fur eine geringe Fehlerrate wahrend der Synthese sorgt ist die Bindung des TP und der Beginn der Synthese vergleichsweise fehlerhaft Sie beginnt bei der zweiten Thyminbase und gleitet dann ein paar Basen zuruck Die f29 DNA Polymerase ist strangversetzend wodurch eine Synthese auch an einem Doppelstrang erfolgen kann Das Leucin an der Position 384 ist an der Spezifitat der Bindung von Desoxynukleotiden beteiligt 2 Tyrosine an den Positionen 226 und 390 sind an der Translokation entlang der Matrize beteiligt 3 Die F29 DNA Polymerase besitzt eine hohere Affinitat zu einzelstrangiger als zu doppelstrangiger DNA Die Tyrosine an den Positionen 256 und 390 bewirken eine Erhohung der Affinitat der Nukleotidbindung 4 Das Tyrosin an der Position 59 das Histidin an der Position 61 und ein Phenylalanin an der Position 69 dienen der DNA Bindung der Exonuklease 5 Die f29 DNA Polymerase ist keine thermostabile DNA Polymerase Die F29 DNA Polymerase katalysiert die Reaktion Desoxynukleosidtriphosphat DNA n displaystyle rightleftharpoons nbsp Diphosphat DNA n 1 Anwendungen BearbeitenDie f29 DNA Polymerase wird in der Biochemie zur isothermen DNA Amplifikation eingesetzt z B beim Gibson Assembly Eine thermostabile Alternative ist das bei 65 C thermostabile grosse Fragment der Bst DNA Polymerase aus Bacillus stearothermophilus Die F29 DNA Polymerase wird zur Kopie von Genomen eingesetzt Genomamplifikation engl whole genome amplification WGA 6 da sie eine hohe Prozessivitat 7 eine geringe Fehlerrate wegen proof reading 8 einen geringen bias besitzt 9 und weil sie lange DNA Fragmente uber 10kb und eine hohere Produktkonzentration als thermostabile DNA Polymerasen erzeugt 9 Als isothermale Methode wird zudem kein Thermocycler benotigt als Primer werden bei der WGA oftmals zufallige Nukleotid Hexamere verwendet Literatur BearbeitenLuis Blanco Margarita Salas Mutational analysis of bacteriophage phi 29 DNA polymerase In Methods in Enzymology Band 262 1995 S 283 294 doi 10 1016 0076 6879 95 62024 9 PMID 8594354 Epub 7 Januar 2004 Weblinks BearbeitenMeSH F29 DNA PolymeraseEinzelnachweise Bearbeiten F B Dean J R Nelson T L Giesler R S Lasken Rapid amplification of plasmid and phage DNA using Phi 29 DNA polymerase and multiply primed rolling circle amplification In Genome Research Band 11 Nummer 6 Juni 2001 S 1095 1099 doi 10 1101 gr 180501 PMID 11381035 PMC 311129 freier Volltext V Truniger J M Lazaro M de Vega L Blanco M Salas phi 29 DNA polymerase residue Leu384 highly conserved in motif B of eukaryotic type DNA replicases is involved in nucleotide insertion fidelity In The Journal of Biological Chemistry Band 278 Nummer 35 August 2003 S 33482 33491 doi 10 1074 jbc M303052200 PMID 12805385 J M Dahl H Wang J M Lazaro M Salas K R Lieberman Dynamics of translocation and substrate binding in individual complexes formed with active site mutants of phi 29 DNA polymerase In The Journal of Biological Chemistry Band 289 Nummer 10 Marz 2014 S 6350 6361 doi 10 1074 jbc M113 535666 PMID 24464581 PMC 3945302 freier Volltext J Saturno L Blanco M Salas J A Esteban A novel kinetic analysis to calculate nucleotide affinity of proofreading DNA polymerases Application to phi 29 DNA polymerase fidelity mutants In The Journal of Biological Chemistry Band 270 Nummer 52 Dezember 1995 S 31235 31243 PMID 8537389 M de Vega J M Lazaro M Salas Phage phi 29 DNA polymerase residues involved in the proper stabilisation of the primer terminus at the 3 5 exonuclease active site In Journal of Molecular Biology Band 304 Nummer 1 November 2000 S 1 9 doi 10 1006 jmbi 2000 4178 PMID 11071805 Alsmadi O Alkayal F Monies D Meyer BF Specific and complete human genome amplification with improved yield achieved by phi29 DNA polymerase and a novel primer at elevated temperature In BMC Res Notes 2 Jahrgang 2009 S 48 doi 10 1186 1756 0500 2 48 PMID 19309528 PMC 2663774 freier Volltext L Blanco A Bernad J M Lazaro G Martin C Garmendia M Salas Highly efficient DNA synthesis by the phage phi 29 DNA polymerase Symmetrical mode of DNA replication In The Journal of biological chemistry Band 264 Nummer 15 Mai 1989 S 8935 8940 PMID 2498321 T J Pugh A D Delaney N Farnoud et al Impact of whole genome amplification on analysis of copy number variants In Nucleic Acids Res 36 Jahrgang Nr 13 August 2008 S e80 doi 10 1093 nar gkn378 PMID 18559357 PMC 2490749 freier Volltext a b R Pinard A de Winter G J Sarkis et al Assessment of whole genome amplification induced bias through high throughput massively parallel whole genome sequencing In BMC Genomics 7 Jahrgang 2006 S 216 doi 10 1186 1471 2164 7 216 PMID 16928277 PMC 1560136 freier Volltext Abgerufen von https de wikipedia org w index php title F29 DNA Polymerase amp oldid 234777629